| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 常见英文缩写词 | 第18-19页 |
| 引言 | 第19-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-49页 |
| 第一节 对虾白斑综合征病毒研究进展 | 第21-30页 |
| 1 对虾白斑综合征病毒概况 | 第21-22页 |
| 2 对虾白斑综合征病毒结构蛋白的研究 | 第22-26页 |
| ·WSSV结构蛋白 | 第22-23页 |
| ·囊膜蛋白的结构与功能 | 第23-25页 |
| ·囊膜蛋白VP28晶体结构 | 第25-26页 |
| 3 对虾白斑综合征病毒致病分子机理 | 第26-28页 |
| 4 对虾白斑综合征病毒防治新进展 | 第28-30页 |
| ·亚单位疫苗 | 第28-29页 |
| ·特异性中和抗体 | 第29页 |
| ·siRNA基因干涉 | 第29-30页 |
| 第二节 甲壳动物的免疫系统与免疫因子 | 第30-33页 |
| 1 血淋巴的主要组分及其作用 | 第30-31页 |
| 2 凝固反应系统(Clotting system) | 第31-32页 |
| ·LPS介导的凝固连锁反应 | 第31页 |
| ·1,3-β-D-葡聚糖介导的凝固连锁反应 | 第31页 |
| ·凝固连锁反应的调控 | 第31-32页 |
| 3 凝集素(Lectin)家族 | 第32页 |
| 4 酚氧化物酶原激活系统(proPO) | 第32页 |
| 5 其它防御分子 | 第32-33页 |
| 6 特异性免疫识别 | 第33页 |
| 第三节 枯草芽孢杆菌作为基因工程宿主菌研究进展 | 第33-43页 |
| 1 枯草芽孢杆菌蛋白分泌机制 | 第34-40页 |
| ·Sec-SRP途径 | 第34-36页 |
| ·Tat途径 | 第36页 |
| ·ABC转运通道 | 第36-37页 |
| ·提高枯草芽孢杆菌蛋白分泌能力的策略 | 第37-40页 |
| 2 枯草芽孢杆菌芽孢形成过程及孢衣蛋白的组装 | 第40-42页 |
| ·芽孢形成关键事件 | 第40页 |
| ·芽孢结构与孢衣蛋白组成 | 第40-41页 |
| ·孢衣蛋白的组装 | 第41页 |
| ·孢衣蛋白——芽孢表面展示系统的装载蛋白 | 第41-42页 |
| 3 枯草芽孢杆菌作为药用蛋白生产与递呈系统的研究 | 第42-43页 |
| 第四节 卵黄抗体(IgY)的结构特性与应用 | 第43-49页 |
| 1 卵黄抗体的形成 | 第43-44页 |
| 2 卵黄抗体的热稳定性和酸稳定性 | 第44-45页 |
| 3 卵黄抗体的结构 | 第45页 |
| 4 卵黄抗体的分离与纯化 | 第45-46页 |
| 5 卵黄抗体的作用机理 | 第46页 |
| 6 特异性卵黄抗体的应用与展望 | 第46-49页 |
| 第二章 以β-葡聚糖酶为报告基因的新型枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建及分泌效率研究 | 第49-70页 |
| 第一节 基于强启动子的穿梭型分泌表达载体的构建 | 第50-58页 |
| 1 试验材料 | 第50-51页 |
| ·宿主菌和载体 | 第50页 |
| ·酶、抗生素和试剂 | 第50页 |
| ·培养基及主要化学试剂的配制 | 第50-51页 |
| 2 试验方法 | 第51-53页 |
| ·引物设计 | 第51页 |
| ·PCR扩增启动子-信号肽序列 | 第51-52页 |
| ·PCR产物PCR/BPS纯化 | 第52页 |
| ·双酶切PCR/BPS片段与pBEC载体 | 第52页 |
| ·连接 | 第52页 |
| ·CaCl_2法制备E.coli TOP 10F’感受态 | 第52-53页 |
| ·E. coli TOP 10F’转化 | 第53页 |
| ·质粒抽提 | 第53页 |
| ·重组质粒鉴定和测序 | 第53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-56页 |
| ·启动子-信号肽片段的克隆 | 第53页 |
| ·双酶切PCR/BPS片段及载体pBEC线性化 | 第53-54页 |
| ·B.subtilis-E.coli穿梭分泌性表达载体pBES全序列 | 第54-56页 |
| ·pBES载体启动子-信号肽序列分析 | 第56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 第二节 β-葡聚糖酶报告基因的分泌表达及分泌效率研究 | 第58-70页 |
| 1 试验材料 | 第58-60页 |
| ·宿主菌和载体 | 第58页 |
| ·酶和试剂 | 第58页 |
| ·培养基及主要化学试剂的配制 | 第58-60页 |
| 2 试验方法 | 第60-64页 |
| ·PCR扩增β-葡聚糖酶成熟肽基因mHG | 第60页 |
| ·酶切、连接 | 第60-61页 |
| ·连接产物E.coli转化 | 第61页 |
| ·重组质粒鉴定及抽提 | 第61页 |
| ·化学法B.subtilis 1A751感受态制备及转化 | 第61页 |
| ·B.subtilis 1A751表达菌株的构建 | 第61页 |
| ·SDS-PAGE | 第61-63页 |
| ·分泌表达重组菌株的发酵试验 | 第63-64页 |
| ·β-葡聚糖酶活力测定 | 第64页 |
| 3 结果与分析 | 第64-68页 |
| ·mHG基因PCR扩增 | 第64页 |
| ·含mHG报告基因的重组载体pBSG构建与转化 | 第64-65页 |
| ·表达菌株分泌上清SDS-PAGE检测 | 第65-66页 |
| ·表达菌株分泌动态分析 | 第66-68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌表达载体信号肽结构区域氨基酸组成对外源蛋白分泌的影响 | 第70-84页 |
| 1 试验材料 | 第71页 |
| ·宿主菌和载体 | 第71页 |
| ·酶、培养基和试剂 | 第71页 |
| 2 试验方法 | 第71-75页 |
| ·信号肽突变基础质粒构建及引物设计 | 第71页 |
| ·信号肽突变 | 第71-75页 |
| ·含β-葡聚糖酶基因的信号肽突变重组载体的构建 | 第75页 |
| ·pBSG信号肽突变体B.subtilis转化与鉴定 | 第75页 |
| ·一系列重组分泌表达菌株上清SDS-PAGE及分泌曲线分析 | 第75页 |
| ·β-葡聚糖酶活力测定 | 第75页 |
| 3 结果与分析 | 第75-81页 |
| ·突变体构建的PCR鉴定 | 第75页 |
| ·突变体测序 | 第75-76页 |
| ·含报告基因的信号肽突变重组表达质粒构建 | 第76页 |
| ·信号肽N区带正电荷数对其分泌能力的影响 | 第76-79页 |
| ·信号肽H区疏水性对其分泌能力的影响 | 第79页 |
| ·筛选高分泌能力的突变信号肽 | 第79-81页 |
| ·高分泌性表达菌株的分泌动态分析 | 第81页 |
| 4 讨论 | 第81-84页 |
| 第四章 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白基因vp28的高效分泌表达及其分泌量动态分析 | 第84-92页 |
| 1 试验材料 | 第85-86页 |
| ·宿主菌和载体 | 第85页 |
| ·WSSV基因组 | 第85页 |
| ·酶和试剂 | 第85页 |
| ·培养基及主要化学试剂的配制 | 第85-86页 |
| 2 试验方法 | 第86-88页 |
| ·vp28基因扩增 | 第86页 |
| ·重组表达载体pBES(H3N2)-VP28与pBES(H3N23)-VP28的构建与鉴定 | 第86-87页 |
| ·B.subtilis WB600电击转化 | 第87页 |
| ·B.subtilis WB600表达菌株的构建 | 第87页 |
| ·Western blot检测 | 第87-88页 |
| ·表达菌株分泌效率SDS-PAGE动态分析 | 第88页 |
| 3 结果与分析 | 第88-91页 |
| ·vp28基因的克隆与序列分析 | 第88页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第88页 |
| ·重组菌株上清SDS-PAGE检测与Western blot鉴定 | 第88-89页 |
| ·表达菌株分泌量SDS-PAGE动态分析 | 第89-91页 |
| 4 讨论 | 第91-92页 |
| 第五章 抗WSSV囊膜蛋白VP28卵黄抗体的制备、提纯与稳定性研究 | 第92-106页 |
| 第一节 WSSV VP28的原核表达与纯化 | 第93-98页 |
| 1 试验材料 | 第93-94页 |
| ·宿主菌和载体 | 第93页 |
| ·酶和试剂 | 第93页 |
| ·主要化学试剂的配制 | 第93-94页 |
| 2 试验方法 | 第94-96页 |
| ·重组质粒pET-VP28的构建与转化 | 第94-95页 |
| ·阳性表达子的筛选与鉴定 | 第95页 |
| ·阳性表达子的诱导表达 | 第95页 |
| ·重组VP28蛋白的纯化与SDS-PAGE检测 | 第95-96页 |
| ·Bradford法测定纯化蛋白浓度 | 第96页 |
| 3 结果与分析 | 第96-97页 |
| ·诱导表达产物SDS-PAGE检测 | 第96页 |
| ·重组VP28蛋白纯化 | 第96页 |
| ·纯化蛋白VP28浓度测定 | 第96-97页 |
| 4 讨论 | 第97-98页 |
| 第二节 抗WSSV VP28卵黄抗体的制备与提纯 | 第98-103页 |
| 1 试验材料 | 第98-99页 |
| ·试验蛋鸡 | 第98页 |
| ·抗原和试剂 | 第98页 |
| ·主要化学试剂配制 | 第98-99页 |
| 2 试验方法 | 第99-100页 |
| ·免疫方法和鸡蛋收集 | 第99页 |
| ·IgY水稀释法粗提 | 第99页 |
| ·间接ELISA抗体效价检测 | 第99-100页 |
| ·IgY饱和硫酸铵纯化 | 第100页 |
| ·冷冻干燥制备anti-VP28 IgY抗体粉 | 第100页 |
| 3 结果与分析 | 第100-102页 |
| ·特异性IgY的抗体效价及其变化规律 | 第100-102页 |
| ·IgY提纯SDS-PAGE检测 | 第102页 |
| ·制备anti-VP28 IgY抗体粉 | 第102页 |
| 4 讨论 | 第102-103页 |
| 第三节 Anti-VP28 IgY的稳定性研究 | 第103-106页 |
| 1 材料与方法 | 第103-104页 |
| ·试验材料 | 第103页 |
| ·试验方法 | 第103-104页 |
| 2 结果与分析 | 第104页 |
| ·温度对IgY稳定性的影响 | 第104页 |
| ·pH对IgY稳定性的影响 | 第104页 |
| ·胃蛋白酶对IgY稳定性的影响 | 第104页 |
| ·渗透压对IgY稳定性的影响 | 第104页 |
| 3 讨论 | 第104-106页 |
| 第六章 口服工程菌B.subtilis-VP28与特异性抗体VP28-IgY对螯虾体内保护效果及机理的研究 | 第106-131页 |
| 第一节 口服B.subtilis-VP28与VP28-IgY的抗病效果 | 第107-117页 |
| 1 试验材料 | 第107-108页 |
| ·种毒与试验动物 | 第107页 |
| ·工程菌与抗体 | 第107页 |
| ·试验虾料 | 第107页 |
| ·其它材料 | 第107页 |
| ·培养基及主要化学试剂的配制 | 第107-108页 |
| 2 试验方法 | 第108-112页 |
| ·病毒增殖 | 第108页 |
| ·WSSV分离纯化 | 第108页 |
| ·WSSV电镜观察 | 第108页 |
| ·病毒体内滴定 | 第108-109页 |
| ·卵黄抗体VP28-IgY中和试验 | 第109页 |
| ·芽孢形成及纯化 | 第109页 |
| ·营养期B.subtilis-VP28制备 | 第109-111页 |
| ·口服免疫试验 | 第111页 |
| ·数据统计 | 第111-112页 |
| 3 结果与分析 | 第112-116页 |
| ·病毒分离纯化 | 第112页 |
| ·病毒感染浓度确定 | 第112-113页 |
| ·VP28-IgY中和试验 | 第113-114页 |
| ·B.subtilis-VP28的保护效果 | 第114页 |
| ·VP28-IgY的保护效果 | 第114-116页 |
| ·比较不同方式B.subtilis-VP28和VP28-IgY的保护效果 | 第116页 |
| 4 讨论 | 第116-117页 |
| 第二节 工程菌B.subtilis-VP28与抗体VP28-IgY免疫保护机理的初步研究 | 第117-131页 |
| 1 材料与方法 | 第117-119页 |
| ·试剂 | 第117页 |
| ·口服B.subtilis-VP28试验分组及血清采集 | 第117-118页 |
| ·口服VP28-IgY试验分组及采样 | 第118页 |
| ·血清酶活力及指标测定 | 第118-119页 |
| ·光镜组织切片方法 | 第119页 |
| ·JEM-1200EX型透射电镜制样方法 | 第119页 |
| ·数据统计 | 第119页 |
| 2 结果与分析 | 第119-128页 |
| ·B.subtilis-VP28对螯虾机体免疫防御能力的影响 | 第119-120页 |
| ·VP28-IgY体内中和病毒的组织光镜观察 | 第120-122页 |
| ·VP28-IgY体内中和病毒的组织电镜观察 | 第122-128页 |
| ·B.subtilis-VP28和VP28-IgY组Caspase-3活力 | 第128页 |
| 3 讨论 | 第128-131页 |
| ·B.subtilis-VP28对螯虾机体免疫因子的影响 | 第128-129页 |
| ·B.subtilis-VP28对螯虾抗氧化功能及自由基代谢的影响 | 第129页 |
| ·VP28-IgY体内中和病毒的组织修复 | 第129-130页 |
| ·B.subtilis-VP28和VP28-IgY抑制WSSV引发的细胞凋亡 | 第130-131页 |
| 第七章 论文提示、创新点及后续研究展望 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-143页 |
| 攻读博士学位期间发表与录用的论文 | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
