| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-46页 |
| ·棒状杆菌内源性质粒及其分子生物学研究工具 | 第12-21页 |
| ·棒状杆菌内源性质粒及其分子分类 | 第12-15页 |
| ·棒状杆菌的分子生物学研究工具 | 第15-21页 |
| ·L-缬氨酸及其生产 | 第21-32页 |
| ·L-缬氨酸及其用途 | 第21-22页 |
| ·L-缬氨酸的生产方法 | 第22页 |
| ·L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制 | 第22-28页 |
| ·国内外L-缬氨酸生产菌株的选育情况 | 第28-32页 |
| ·立题背景与研究内容 | 第32-33页 |
| 参考文献 | 第33-46页 |
| 第二章 新型大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8 的构建 | 第46-63页 |
| ·引言 | 第46页 |
| ·材料与方法 | 第46-54页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第46页 |
| ·培养基及用途 | 第46页 |
| ·主要仪器 | 第46-48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第49页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第49页 |
| ·黄色短杆菌/谷氨酸棒杆菌感受态的制备 | 第49-50页 |
| ·质粒的小量提取 | 第50页 |
| ·PCR 反应 | 第50-51页 |
| ·PCR 产物或质粒的酶切 | 第51页 |
| ·PCR 产物或酶切产物的纯化 | 第51-52页 |
| ·单酶切后质粒的去磷酸化 | 第52页 |
| ·PCR 产物和质粒的连接反应 | 第52页 |
| ·质粒或连接产物转化感受态细胞 | 第52页 |
| ·菌种保藏 | 第52-53页 |
| ·穿梭表达载体的构建 | 第53页 |
| ·质粒pDXW-8 的稳定性试验 | 第53页 |
| ·重组质粒pDXW-8-vhb 的构建 | 第53-54页 |
| ·透明颤菌血红蛋白VHb 表达的SDS-PAGE 分析 | 第54页 |
| ·透明颤菌血红蛋白VHb 活性分析 | 第54页 |
| ·结果和分析 | 第54-61页 |
| ·表达载体pDXW-8 的构建 | 第54-57页 |
| ·质粒稳定性的研究 | 第57-58页 |
| ·重组质粒pDXW-8-vhb 的构建及其转化大肠杆菌、黄色短杆菌和谷氨酸棒杆菌 | 第58页 |
| ·vhb 在大肠杆菌、黄色短杆菌及谷氨酸棒杆菌中的表达情况 | 第58-61页 |
| ·讨论 | 第61页 |
| ·本章小结 | 第61页 |
| 参考文献 | 第61-63页 |
| 第三章 大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭型启动子探测载体pDXW-11 的构建及应用 | 第63-77页 |
| ·引言 | 第63页 |
| ·材料与方法 | 第63-68页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第63页 |
| ·培养基及用途 | 第63页 |
| ·主要仪器 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第63页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第63页 |
| ·大肠杆菌(E. coli) JM109 感受态的制备 | 第63页 |
| ·黄色短杆菌感受态的制备 | 第63-64页 |
| ·质粒的小量提取 | 第64页 |
| ·载体DNA 或PCR 产物的酶切 | 第64页 |
| ·PCR 产物或酶切产物的纯化 | 第64页 |
| ·PCR 产物和质粒的连接反应 | 第64-65页 |
| ·质粒或连接产物转化入感受态细胞 | 第65页 |
| ·菌种保藏 | 第65页 |
| ·制备启动子DNA 片断的寡核苷酸退火法 | 第65-66页 |
| ·基础大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pDXW-2 的构建 | 第66页 |
| ·启动子探测载体pDXW-11 的构建 | 第66-67页 |
| ·质粒pDXW-11 的稳定性试验 | 第67页 |
| ·几种启动子DNA 片断的制备 | 第67页 |
| ·携带启动子片断的重组启动子探测载体的构建及转化 | 第67页 |
| ·氯霉素酰基转移酶（CAT）表达的SDS-PAGE 分析 | 第67页 |
| ·氯霉素活性测定 | 第67-68页 |
| ·结果与分析 | 第68-74页 |
| ·基础大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭质粒pDXW-2 的构建 | 第68-70页 |
| ·启动子探测载体pDXW-11 的构建 | 第70-72页 |
| ·质粒的稳定性研究 | 第72页 |
| ·几种启动子在黄色短杆菌中的活性比较 | 第72-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·本章小结 | 第75页 |
| 参考文献 | 第75-77页 |
| 第四章 大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭组成型表达载体pDXW-10 的构建 | 第77-88页 |
| ·引言 | 第77页 |
| ·材料与方法 | 第77-81页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第77页 |
| ·培养基及用途 | 第77页 |
| ·主要仪器 | 第77页 |
| ·主要试剂 | 第77页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第77页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第77页 |
| ·大肠杆菌(E. coli) JM109 感受态的制备 | 第77-78页 |
| ·黄色短杆菌感受态的制备 | 第78页 |
| ·质粒的小量提取 | 第78-79页 |
| ·载体DNA 或PCR 产物的酶切 | 第79页 |
| ·PCR 产物或酶切产物的纯化 | 第79页 |
| ·PCR 产物和质粒的连接反应 | 第79页 |
| ·质粒或连接产物转化入感受态细胞 | 第79页 |
| ·菌种保藏 | 第79页 |
| ·表达载体pDXW-10 的构建 | 第79-81页 |
| ·重组质粒pDXW-10-cat 的构建及转化 | 第81页 |
| ·氯霉素酰基转移酶（CAT）表达的SDS-PAGE 分析 | 第81页 |
| ·氯霉素活性测定 | 第81页 |
| ·结果 | 第81-86页 |
| ·E. coli-B. flavum 穿梭载体pDXW-9 的构建 | 第81-82页 |
| ·通过定点突变技术获得pDXW-10 载体 | 第82-83页 |
| ·重组质粒pDXW-10-cat 的构建及其转化大肠杆菌、黄色短杆菌 | 第83-84页 |
| ·cat 在大肠杆菌、黄色短杆菌中的表达情况 | 第84-86页 |
| ·讨论 | 第86-87页 |
| ·本章小结 | 第87页 |
| 参考文献 | 第87-88页 |
| 第五章 黄色短杆菌整合型载体构建的初步研究 | 第88-101页 |
| ·引言 | 第88-89页 |
| ·材料和方法 | 第89-93页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第89页 |
| ·培养基及用途 | 第89-90页 |
| ·主要仪器 | 第90页 |
| ·主要试剂 | 第90页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第90页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第90-91页 |
| ·黄色短杆菌感受态的制备 | 第91页 |
| ·质粒的小量提取 | 第91页 |
| ·载体DNA 或PCR 产物的酶切 | 第91页 |
| ·载体DNA 或PCR 产物的酶切 | 第91页 |
| ·PCR 产物和质粒的连接反应 | 第91页 |
| ·质粒或连接产物转化感受态细胞 | 第91页 |
| ·菌种保藏 | 第91页 |
| ·重组质粒pK18mobsacB-rep 的构建 | 第91页 |
| ·使用不同启动子的sacB 基因的PCR 扩增 | 第91-92页 |
| ·携带使用不同启动子的sacB 基因的重组E. coli-B. flavum 穿梭载体的构建及转化 | 第92页 |
| ·B. flavum 整合型载体pDXW-3 的构建 | 第92页 |
| ·应用重叠PCR 技术制备ΔilvA 片段 | 第92页 |
| ·重组质粒pDXW-3-ΔilvA 的构建 | 第92-93页 |
| ·结果和分析 | 第93-98页 |
| ·重组质粒pK18mobsacB-rep 的构建及对黄色短杆菌的转化效率 | 第93-94页 |
| ·基于E. coli-B. flavum 穿梭载体pDXW-2 的携带不同启动子的sacB 基因对大肠杆菌及黄色短杆菌的条件型致死作用 | 第94-95页 |
| ·具有双筛选标记的黄色短杆菌整合型载体的构建 | 第95-96页 |
| ·重叠PCR 制备ΔilvA 片段 | 第96-97页 |
| ·黄色短杆菌整合型载体的可用性验证 | 第97-98页 |
| ·讨论 | 第98-99页 |
| ·本章小结 | 第99页 |
| 参考文献 | 第99-101页 |
| 第六章 过表达抗反馈抑制基因ilvBNr黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L-缬氨酸积累 | 第101-110页 |
| ·引言 | 第101页 |
| ·材料和方法 | 第101-104页 |
| ·菌株和质粒 | 第101页 |
| ·培养基及用途 | 第101页 |
| ·主要仪器 | 第101-102页 |
| ·主要试剂 | 第102页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第102页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第102页 |
| ·黄色短杆菌感受态的制备 | 第102页 |
| ·质粒的小量提取 | 第102页 |
| ·载体DNA 或PCR 产物的酶切 | 第102页 |
| ·PCR 产物或酶切产物的纯化 | 第102页 |
| ·PCR 产物和质粒的连接反应 | 第102-103页 |
| ·质粒或连接产物转化入感受态细胞 | 第103页 |
| ·菌种保藏 | 第103页 |
| ·PCR 扩增野生型ilvBN | 第103页 |
| ·ilvBN 基因的定点突变 | 第103页 |
| ·重组质粒pDXW-10-ilvBNr 的构建及转化 | 第103页 |
| ·摇瓶种子生长曲线的测定 | 第103-104页 |
| ·工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr 的3L 罐发酵 | 第104页 |
| ·菌浓测定 | 第104页 |
| ·残糖测定 | 第104页 |
| ·氨基酸含量测定 | 第104页 |
| ·结果与分析 | 第104-107页 |
| ·乙酰羟酸合酶编码基因的PCR 扩增及定点突变 | 第104-105页 |
| ·重组质粒pDXW-10-ilvBNr 的构建及转化黄色短杆菌 | 第105页 |
| ·摇瓶种子生长曲线的测定 | 第105-106页 |
| ·工程菌3L 罐发酵水平的L-缬氨酸积累 | 第106-107页 |
| ·讨论 | 第107-108页 |
| ·本章小结 | 第108页 |
| 参考文献 | 第108-110页 |
| 结论 | 第110页 |
| 论文创新点 | 第110-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第113页 |
