| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 英文缩写词表 | 第12-14页 |
| 第1章 引言 | 第14-26页 |
| 1.1 Rev-erbβ的结构和基因定位 | 第14-16页 |
| 1.1.1 Rev-erbβ结构 | 第14-15页 |
| 1.1.2 Rev-erbβ基因的定位和组织分布 | 第15-16页 |
| 1.2 Rev-erbs的转录调节机制 | 第16-17页 |
| 1.2.1 核受体转录调节机制 | 第16-17页 |
| 1.2.2 核受体Rev-erbs转录调节机制 | 第17页 |
| 1.3 天然配体及人工合成配体对Rev-erbβ功能的影响 | 第17-19页 |
| 1.3.1 Rev-erbβ天然配体的发现及转录调控机制 | 第17-18页 |
| 1.3.2 人工合成配体对Rev-erbβ功能的影响 | 第18-19页 |
| 1.4 Rev-erbβ的生物学功能 | 第19-23页 |
| 1.4.1 Rev-erbβ参与调节生物昼夜节律 | 第19页 |
| 1.4.2 Rev-erbβ与脂质代谢 | 第19-20页 |
| 1.4.3 Rev-erbβ与糖代谢 | 第20页 |
| 1.4.4 Rev-erbs参与生理节律及能量代谢 | 第20-22页 |
| 1.4.5 Rev-erbβ与炎症 | 第22页 |
| 1.4.6 Rev-erbβ与肿瘤 | 第22-23页 |
| 1.5 颗粒前体蛋白(Progranulin,PGRN) | 第23-24页 |
| 1.5.1 PGRN分子概述 | 第23页 |
| 1.5.2 与PGRN相互作用的分子 | 第23-24页 |
| 1.6 结语 | 第24-26页 |
| 第2章 针对人Rev-erbβ单克隆抗体的制备 | 第26-56页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第26-30页 |
| 2.1.1 细胞和载体 | 第26-27页 |
| 2.1.2 实验主要材料和试剂 | 第27页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第27-28页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第28-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 人Rev-erbα及Rev-erbβ基因的克隆 | 第30-33页 |
| 2.2.2 大肠杆菌E.coli DH5和E.coli BL21 DE3感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| 2.2.3 携带有目的基因片段的克隆载体转化、涂布培养及阳性克隆的筛选 | 第34-36页 |
| 2.2.4 携带hRev-erbβ-6His、hRev-erbβ-Flag和hRev-erbα-Flag表达载体的构建 | 第36页 |
| 2.2.5 PCR扩增Rev-erbβ基因的截短体及其相关载体的构建与表达 | 第36-37页 |
| 2.2.6 hRev-erbβ-6His重组蛋白的原核表达与纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.7 Rev-erbβ单克隆抗体的制备 | 第38-39页 |
| 2.2.8 细胞培养、质粒转化及细胞裂解液的制备 | 第39页 |
| 2.2.9 Western blot检测 | 第39-40页 |
| 2.2.10 免疫荧光细胞染色(Immunofluorescen cytochemistry)检测 | 第40-41页 |
| 2.2.11 免疫沉淀实验(Immunoprecipitation,IP)分析 | 第41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-54页 |
| 2.3.1 人Rev-erbβ及Rev-erbα基因克隆的结果 | 第41-43页 |
| 2.3.2 构建hRev-erbβ-6His、hRev-erbβ-Flag和hRev-erbα-Flag表达载体的结果 | 第43-44页 |
| 2.3.3 hRev-erbβ-6His原核诱导表达、纯化及鉴定结果 | 第44-45页 |
| 2.3.4 构建hRev-erbβ基因截短体相关载体和诱导GST融合蛋白表达的结果 | 第45-47页 |
| 2.3.5 Rev-erbβ单克隆抗体的鉴定结果 | 第47-49页 |
| 2.3.6 Rev-erbβ单抗识别Rev-erbβ特定结构域的检测结果 | 第49-51页 |
| 2.3.7 Rev-erbβ单抗检测内源Rev-erbβ表达的结果 | 第51-53页 |
| 2.3.8 Rev-erbβ的单抗与人源Rev-erbα蛋白的交叉反应 | 第53-54页 |
| 2.4 讨论 | 第54-56页 |
| 第3章 Rev-erbβ与PGRN相互作用的验证及其结合部位的确定 | 第56-80页 |
| 3.1 实验的主要材料、试剂和仪器 | 第57-62页 |
| 3.1.1 所用的细胞系和主要载体 | 第57-58页 |
| 3.1.2 实验所用的主要仪器设备 | 第58页 |
| 3.1.3 实验材料和试剂 | 第58-59页 |
| 3.1.4 实验试剂的配制 | 第59-62页 |
| 3.2 实验方法 | 第62-67页 |
| 3.2.1 本实验所用的相关载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.2.2 利用酵母双杂交系统验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用 | 第63-64页 |
| 3.2.3 Rev-erbβ与PGRN的相互作用结合部位的确定 | 第64-65页 |
| 3.2.4 利用免疫共沉淀法(Co-IP)检测Rev-erbβ与PGRN的相互作用 | 第65-66页 |
| 3.2.5 利用GST- pull down验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用 | 第66-67页 |
| 3.2.6 Rev-erbβ、PGRN在细胞内的共定位情况的检测 | 第67页 |
| 3.3 实验结果 | 第67-77页 |
| 3.3.1 本章实验所构建相关载体的结果 | 第67-70页 |
| 3.3.2 Rev-erbβ与PGRN的相互作用的验证结果 | 第70-72页 |
| 3.3.3 GST-pull down验证Rev-erbβ与PGRN相互作用的结果 | 第72-75页 |
| 3.3.4 免疫共沉淀验证Rev-erbβ与PGRN的相互作用的结果 | 第75-76页 |
| 3.3.5 Rev-erbβ与PGRN在细胞内的共定位研究结果 | 第76-77页 |
| 3.4 讨论 | 第77-80页 |
| 第4章 PGRN对Rev-erbβ靶基因表达调控的分子机制研究 | 第80-116页 |
| 4.1 实验主要材料 | 第81-85页 |
| 4.1.1 细胞系和菌株 | 第81页 |
| 4.1.2 主要载体和质粒 | 第81-82页 |
| 4.1.3 本章实验中所用到的引物 | 第82-84页 |
| 4.1.4 主要试剂 | 第84页 |
| 4.1.5 主要溶液的配制 | 第84-85页 |
| 4.1.6 主要仪器及设备 | 第85页 |
| 4.2 实验方法 | 第85-95页 |
| 4.2.1 GAL4(BD)-Rev-erbβ-E/6×UAS-CMV-Luciferase检测系统的构建 | 第85-87页 |
| 4.2.2 相关启动子克隆、载体构建及活性检测 | 第87-88页 |
| 4.2.3 Rev-erbβ和PGRN基因双敲除HEK293细胞系的构建 | 第88-93页 |
| 4.2.4 PGRN介导Rev-erbβ对靶基因转录活性调控的影响 | 第93-95页 |
| 4.2.5 细胞培养 | 第95页 |
| 4.2.6 细胞总RNA的提取 | 第95页 |
| 4.3 实验结果 | 第95-114页 |
| 4.3.1 GAL4 (BD)-Rev-erbβ-E与6×UAS-CMV/SV40-Luciferase检测统构建结果 | 第95-98页 |
| 4.3.2 相关启动子克隆、载体构建及活性检测结果 | 第98-101页 |
| 4.3.3 Rev-erbβ和PGRN基因双敲除的HEK293细胞系的构建 | 第101-109页 |
| 4.3.4 PGRN与Rev-erbβ相互作用对靶基因转录活性调控影响的结果 | 第109-114页 |
| 4.4 讨论 | 第114-116页 |
| 第5章 Rev-erbβ在肝癌HepG2细胞中功能的研究 | 第116-138页 |
| 5.1 实验主要材料 | 第117-119页 |
| 5.1.1 细胞系和菌株 | 第117页 |
| 5.1.2 主要载体和质粒 | 第117页 |
| 5.1.3 本章实验中所用到的引物 | 第117-118页 |
| 5.1.4 主要试剂 | 第118页 |
| 5.1.5 主要溶液的配制 | 第118-119页 |
| 5.1.6 主要仪器 | 第119页 |
| 5.2 实验方法 | 第119-123页 |
| 5.2.1 HepG2相关细胞系的构建 | 第119-120页 |
| 5.2.2 细胞RNA提取、反转录及Real time PCR | 第120-121页 |
| 5.2.3 MTT法检测细胞的增殖活性 | 第121页 |
| 5.2.4 划痕和Transwell检测细胞迁移能力 | 第121-122页 |
| 5.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 | 第122-123页 |
| 5.2.6 腺病毒pAd5-E1-CMV-Rev-erbβ回补实验 | 第123页 |
| 5.3 实验结果 | 第123-134页 |
| 5.3.1 Rev-erbβ基因敲除HepG2细胞系的构建与鉴定结果 | 第123-126页 |
| 5.3.2 Rev-erbβ在肝癌HepG2细胞中功能研究结果 | 第126-134页 |
| 5.4 讨论 | 第134-138页 |
| 第6章 结论 | 第138-140页 |
| 参考文献 | 第140-152页 |
| 致谢 | 第152-154页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第154页 |
