| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 英文缩写词表 | 第15-18页 |
| 第一章 引言 | 第18-34页 |
| 1 PGRN基因及研究现状 | 第18-25页 |
| 1.1 Pgrn基因定位、蛋白结构及其表达的组织分布 | 第18-19页 |
| 1.2 PGRN的生物学功能 | 第19-25页 |
| 2 ECM1基因及研究现状 | 第25-28页 |
| 2.1 Ecm1基因定位、蛋白结构及其表达的组织分布 | 第25页 |
| 2.2 ECM1的生物学功能 | 第25-28页 |
| 3 课题研究意义 | 第28-30页 |
| 4 课题技术路线 | 第30-34页 |
| 4.1 ECM1单克隆抗体的制备 | 第30-31页 |
| 4.2 用于检测ECM1的双夹心ELISA试剂盒建立 | 第31页 |
| 4.3 PGRN与ECM1蛋白相互作用验证及结合部位确定 | 第31-32页 |
| 4.4 PGRN与ECM1相互作用参与肿瘤增殖及转移的机制研究 | 第32-33页 |
| 4.5 PGRN通过与ECM1或EGFR相互作用调节肿瘤的增殖及转移之间的平衡 | 第33-34页 |
| 第二章 ECM1单克隆抗体的制备、鉴定及功能研究 | 第34-60页 |
| 1 实验材料和试剂配制 | 第34-36页 |
| 1.1 实验材料 | 第34页 |
| 1.2 主要试剂配制 | 第34-35页 |
| 1.3 所用仪器 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-45页 |
| 2.1 人Ecm1全长基因的克隆 | 第36-37页 |
| 2.2 pGEMT/Ecm1 sp及pGEMT/Ecm1 no sp阳性克隆质粒的鉴定 | 第37页 |
| 2.3 Ecm1结构域的克隆 | 第37-39页 |
| 2.4 Ecm1、 Ecm1 N-terminal、 RepeatⅠ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核表达载体构建 | 第39页 |
| 2.5 ECM1-6His原核蛋白的表达及纯化 | 第39-40页 |
| 2.6 ECM1 N-terminal、Repeat Ⅰ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核蛋白表达 | 第40页 |
| 2.7 ECM1-Flag真核表达载体构建 | 第40页 |
| 2.8 ECM1单克隆抗体的制备 | 第40-41页 |
| 2.9 ECM1单克隆抗体腹水的纯化 | 第41-42页 |
| 2.10 SDS-PAGE及Western blot检测 | 第42页 |
| 2.11 辣根过氧化物酶标记ECM1单克隆抗体 | 第42-43页 |
| 2.12 竞争ELISA检测ECM1单克隆抗体 | 第43页 |
| 2.13 免疫沉淀技术检测ECM1单克隆抗体 | 第43页 |
| 2.14 免疫组织化学技术检测ECM1单克隆抗体 | 第43-44页 |
| 2.15 ECM1单克隆抗体生物学功能研究 | 第44-45页 |
| 3 实验结果 | 第45-58页 |
| 3.1 Ecm1基因的克隆 | 第45-46页 |
| 3.2 ECM1-6His原核表达载体及ECM1-Flag真核表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.3 ECM1 N-terminal、Repeat ⅠI、RepeatⅡ及C-terminal原核表达载体构建 | 第47-48页 |
| 3.4 ECM1-6His原核表达蛋白表达与纯化 | 第48-50页 |
| 3.5 ECM1 N-terminal、RepeatⅠ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核蛋白表达 | 第50-51页 |
| 3.6 ECM1单克隆抗体重链亚型鉴定及抗体纯化 | 第51页 |
| 3.7 Western blot检测ECM1单克隆抗体 | 第51-52页 |
| 3.8 免疫荧光细胞染色鉴定ECM1单克隆抗体 | 第52-53页 |
| 3.9 单克隆抗体针对ECM1结构域的鉴定 | 第53-54页 |
| 3.10 免疫沉淀检测ECM1单克隆抗体 | 第54-55页 |
| 3.11 ECM1单克隆抗体检测肿瘤细胞及组织内源性ECM1的表达 | 第55-56页 |
| 3.12 ECM1单克隆抗体对细胞增殖、侵袭及迁移的影响 | 第56-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第三章 针对人ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 | 第60-76页 |
| 1. 实验材料 | 第60页 |
| 2. 实验方法 | 第60-63页 |
| 2.1 ECM1-6His真核蛋白的表达及纯化 | 第60-61页 |
| 2.2 Avidin-6His、 Luciferase-6His及Luciferase-(GGGGS)3-Avdin原核蛋白的表达与纯化 | 第61页 |
| 2.3 ECM1单克隆抗体效价检测 | 第61-62页 |
| 2.4 HRP或Biotin标记ECM1单克隆抗体 | 第62页 |
| 2.5 ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 | 第62页 |
| 2.6 Avidin与Luciferase蛋白交联 | 第62-63页 |
| 3. 结果 | 第63-73页 |
| 3.1 ECM1-6His真核蛋白的表达及纯化 | 第63-64页 |
| 3.2 ECM1单克隆抗体效价检测 | 第64-65页 |
| 3.3 ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 | 第65-69页 |
| 3.4 ECM1双夹心ELISA试剂盒的优化 | 第69-73页 |
| 4. 讨论 | 第73-76页 |
| 第四章 PGRN与ECM1蛋白相互作用验证及结合部位确定 | 第76-90页 |
| 1. 实验材料 | 第76-78页 |
| 1.1 质粒与细胞 | 第76页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第76-78页 |
| 2. 实验方法 | 第78-82页 |
| 2.1 酵母双杂交筛选与PGRN相互作用的分子 | 第78页 |
| 2.2 酵母表达载体pGADT7/Ecm1 no sp、pGADT7/Ecm1 N-terminal、pGADT7/Ecm1 Repeat Ⅰ、pGADT7/Ecm1 Repeat Ⅱ及pGADT7/Ecm1 C-terminal的构建 | 第78-79页 |
| 2.3 PGRN与ECM1在酵母细胞内的相互作用及结合结构域研究 | 第79-80页 |
| 2.4 PGRN和ECM1蛋白在体外的相互作用研究 | 第80页 |
| 2.5 PGRN和ECM1在哺乳动物细胞内的相互作用研究 | 第80-81页 |
| 2.6 肿瘤病人血清ECM1表达水平研究 | 第81页 |
| 2.7 不同肿瘤细胞系中PGRN与ECM1表达水平研究 | 第81页 |
| 2.8 PGRN和ECM1在肿瘤组织中共定位研究 | 第81-82页 |
| 3. 实验结果 | 第82-88页 |
| 3.1 酵母双杂交验证ECM1与PGRN的相互作用 | 第82-83页 |
| 3.2 PGRN与ECM1相互作用的结合位点研究 | 第83-85页 |
| 3.3 PGRN和ECM1蛋白在体外的相互作用研究 | 第85页 |
| 3.4 PGRN与ECM1在哺乳动物细胞内的相互作用研究 | 第85-86页 |
| 3.5 肿瘤病人血清ECM1表达水平研究 | 第86-87页 |
| 3.6 不同肿瘤细胞系中PGRN与ECM1表达水平研究 | 第87页 |
| 3.7 PGRN和ECM1在乳腺癌组织切片中共定位研究 | 第87-88页 |
| 4. 讨论 | 第88-90页 |
| 第五章 PGRN与ECM1相互作用参与乳腺癌转移的机制研究 | 第90-120页 |
| 1. 实验材料 | 第90页 |
| 2. 实验方法 | 第90-100页 |
| 2.1 Ecm1与Pgrn基因敲除sgRNA引物设计 | 第90-93页 |
| 2.2 Ecm1基因敲除细胞系建立 | 第93-96页 |
| 2.3 Pgrn基因敲除细胞系建立 | 第96-97页 |
| 2.4 Real time PCR检测基因敲除细胞系中ECM1与PGRN的mRNA表达水平 | 第97-98页 |
| 2.5 Western blot检测基因敲除细胞系中ECM1与PGRN的蛋白表达水平 | 第98页 |
| 2.6 MDA-MB-231 WT、ECM1~(-/-)和PGRN~(-/-)细胞增殖、侵袭与迁移能力体外研究 | 第98-99页 |
| 2.7 ECM1与PGRN相互作用参与乳腺癌转移过程中所涉及的信号通路研究 | 第99-100页 |
| 2.8 ECM1与PGRN相互作用在MDA-MB-231细胞增殖与转移过程的体内功能研究 | 第100页 |
| 3. 实验结果 | 第100-116页 |
| 3.1 MDA-MB-231 ECM1~(-/-)细胞系的建立及鉴定 | 第100-104页 |
| 3.2 MDA-MB-231 PGRN~(-/-)细胞系的建立及鉴定 | 第104-106页 |
| 3.3 ECM1与PGRN对MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响 | 第106-108页 |
| 3.4 ECM1与PGRN相互作用对乳腺癌转移过程中所涉及的信号通路的影响 | 第108-111页 |
| 3.5 ECM1与PGRN相互作用在MDA-MB-231细胞增殖与转移过程的体内功能研究 | 第111-116页 |
| 4. 讨论 | 第116-120页 |
| 第六章 PGRN通过与ECM1或EGFR相互作用调节乳腺癌增殖及转移之间的平衡 | 第120-138页 |
| 1. 实验材料 | 第120页 |
| 2. 实验方法 | 第120-125页 |
| 2.1 Egfr extracellular domain表达载体构建 | 第120-122页 |
| 2.2 EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系研究 | 第122-123页 |
| 2.3 免疫共沉淀研究EGFR与PGRN相互作用关系 | 第123页 |
| 2.4 固相竞争试验研究EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系 | 第123页 |
| 2.5 MDA-MB-231 EGFR KD细胞系建立 | 第123-124页 |
| 2.6 MDA-MB-231 EGFR KD细胞增殖能力研究 | 第124-125页 |
| 2.7 MDA-MB-231 EGFR KD细胞侵袭与迁移能力体外研究 | 第125页 |
| 2.8 EGFR与PGRN参与乳腺癌转移相关信号通路的研究 | 第125页 |
| 3. 实验结果 | 第125-135页 |
| 3.1 EGFR、PGRN及ECM1三种分子间相互作用的研究 | 第125-129页 |
| 3.2 EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系研究 | 第129-130页 |
| 3.3 MDA-MB-231 EGFR KD细胞增殖研究 | 第130-132页 |
| 3.4 MDA-MB-231 EGFR KD细胞的侵袭与迁移功能研究 | 第132-133页 |
| 3.5 EGFR对乳腺癌侵袭与迁移相关信号通路的研究 | 第133-135页 |
| 4. 讨论 | 第135-138页 |
| 结论 | 第138-140页 |
| 参考文献 | 第140-156页 |
| 附录 | 第156-164页 |
| 致谢 | 第164-166页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第166页 |
