| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第15-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-41页 |
| 1 课题的提出 | 第17-18页 |
| 2 植物类胡萝卜素代谢研究进展 | 第18-39页 |
| 2.1 类胡萝卜素简介 | 第18-19页 |
| 2.2 植物类胡萝卜素代谢 | 第19-33页 |
| 2.2.1 植物类胡萝卜素代谢途径 | 第19-21页 |
| 2.2.2 植物类胡萝卜素代谢途径上主要结构基因 | 第21-26页 |
| 2.2.3 影响植物类胡萝卜素代谢的因素 | 第26-33页 |
| 2.3 植物类胡萝卜素代谢的分子调控 | 第33-37页 |
| 2.3.1 转录水平调控 | 第33-35页 |
| 2.3.2 其他分子水平调控 | 第35-37页 |
| 2.4 柑橘类胡萝卜素代谢研究进展 | 第37-39页 |
| 2.4.1 柑橘类胡萝卜素代谢 | 第37-38页 |
| 2.4.2 柑橘类胡萝卜素代谢与番茄红素β-环化酶基因 | 第38-39页 |
| 3 本研究的目的和内容 | 第39-41页 |
| 第二章 柑橘LCYb基因功能分析 | 第41-51页 |
| 1 引言 | 第41-42页 |
| 2 材料和方法 | 第42-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 2.2.1 DNA提取、RNA提取及cDNA合成 | 第42页 |
| 2.2.2 基因克隆及序列分析 | 第42页 |
| 2.2.3 实时定量PCR | 第42-43页 |
| 2.2.4 原核表达载体构建及工程菌实验 | 第43-44页 |
| 2.2.5 细菌类胡萝卜素提取及测定 | 第44页 |
| 2.2.6 点突变 | 第44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-49页 |
| 3.1 甜橙LCYb基因表达分析 | 第44-45页 |
| 3.2 不同柑橘品种LCYb2基因序列的等位多态性分析 | 第45-47页 |
| 3.3 不同柑橘品种LCYb2环化酶活性分析 | 第47-49页 |
| 3.4 甜橙2个LCYb2等位基因的点突变分析 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 4.1 柑橘中LCYb2基因的重要作用 | 第49页 |
| 4.2 柑橘LCYb2基因的等位多态性与不同柑橘品种的进化关系有关 | 第49-50页 |
| 4.3 72 位和359位氨基酸是影响LCYb2酶活性的关键位点 | 第50-51页 |
| 第三章 柑橘LCYb启动子的克隆和活性分析 | 第51-74页 |
| 1 引言 | 第51-52页 |
| 2 材料与方法 | 第52-57页 |
| 2.1 实验材料 | 第52页 |
| 2.2 实验方法 | 第52-57页 |
| 2.2.1 DNA提取 | 第52页 |
| 2.2.2 启动子克隆 | 第52-53页 |
| 2.2.3 启动子序列生物信息学分析 | 第53页 |
| 2.2.4 启动子表达载体构建 | 第53-55页 |
| 2.2.5 农杆菌介导的番茄果实瞬时转化 | 第55页 |
| 2.2.6 农杆菌介导的拟南芥稳定转化 | 第55页 |
| 2.2.7 农杆菌介导的柑橘愈伤组织稳定转化 | 第55页 |
| 2.2.8 外源因子处理 | 第55-56页 |
| 2.2.9 GUS定性定量检测 | 第56页 |
| 2.2.10 简单序列重复(SSR)标记 | 第56页 |
| 2.2.11 数据分析 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-69页 |
| 3.1 甜橙CsLCYb1启动子序列分析 | 第57-60页 |
| 3.2 瞬时表达番茄果实中CsLCYb1启动子活性分析 | 第60页 |
| 3.3 稳定转化拟南芥植株中CsLCYb1启动子活性分析 | 第60-62页 |
| 3.3.1 CsLCYb1不同启动子缺失片段的组织特异性活性分析 | 第60-61页 |
| 3.3.2 CsLCYb1全长启动子在转基因拟南芥不同发育时期的活性分析 | 第61页 |
| 3.3.3 CsLCYb1不同启动子缺失片段在转基因拟南芥中的活性比较 | 第61-62页 |
| 3.4 稳定转化柑橘愈伤组织中CsLCYb1启动子活性分析 | 第62-63页 |
| 3.4.1 CsLCYb1不同启动子缺失片段在转基因愈伤中的活性比较 | 第62页 |
| 3.4.2 CsLCYb1不同启动子缺失片段响应外源因子处理的活性变化 | 第62-63页 |
| 3.5 CsLCYb1启动子精细缺失分析 | 第63-64页 |
| 3.6 其他柑橘品种LCYb1启动子序列分析 | 第64-65页 |
| 3.7 甜橙CsLCYb2启动子序列分析 | 第65-69页 |
| 3.8 瞬时表达番茄果实中CsLCYb2启动子活性分析 | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-74页 |
| 4.1 CsLCYb1不同启动子缺失片段表达特点 | 第70页 |
| 4.2 CsLCYb1启动子响应不同外源和内源因子的表达特点 | 第70-71页 |
| 4.3 一个新的增强子元件与CsLCYb1启动子活性密切相关 | 第71-72页 |
| 4.4 不同柑橘品种LCYb1启动子上增强子元件拷贝数差异 | 第72-73页 |
| 4.5 CsLCYb2启动子分析为等位基因差异表达的分子机制研究奠定了基础 | 第73-74页 |
| 第四章 柑橘LCYb启动子互作因子的筛选 | 第74-88页 |
| 1 引言 | 第74-76页 |
| 2 材料与方法 | 第76-80页 |
| 2.1 实验材料 | 第76-77页 |
| 2.1.1 酵母菌株及质粒 | 第76页 |
| 2.1.2 酵母实验中所使用的主要试剂 | 第76-77页 |
| 2.2 实验方法 | 第77-80页 |
| 2.2.1 酵母培养基及溶液配方 | 第77页 |
| 2.2.2 构建诱饵载体pAbAi-Bait | 第77-78页 |
| 2.2.3 获得诱饵酵母菌株Y1HGold[pAbAi-Bait] | 第78-79页 |
| 2.2.4 检测诱饵酵母菌株的AbA最佳使用浓度 | 第79页 |
| 2.2.5 构建cDNA文库 | 第79页 |
| 2.2.6 酵母单杂交筛选文库 | 第79-80页 |
| 2.2.7 阳性克隆再筛选及测序分析 | 第80页 |
| 3 结果与分析 | 第80-85页 |
| 3.1 诱饵质粒pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb的构建 | 第80-81页 |
| 3.2 诱饵菌株Y1H[pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb]的获得 | 第81-82页 |
| 3.3 检测4个诱饵酵母菌株的AbA最佳使用浓度 | 第82-83页 |
| 3.4 甜橙果实cDNA文库构建 | 第83-84页 |
| 3.5 cDNA文库筛选 | 第84页 |
| 3.6 阳性克隆的序列分析 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-88页 |
| 4.1 酵母单杂交系统探讨 | 第85页 |
| 4.2 筛选的几个候选转录因子生物学功能探讨 | 第85-88页 |
| 第五章 候选转录因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能分析 | 第88-139页 |
| 1 引言 | 第88-89页 |
| 2 材料与方法 | 第89-95页 |
| 2.1 实验材料 | 第89页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第89页 |
| 2.1.2 菌株、质粒和载体 | 第89页 |
| 2.2 实验方法 | 第89-95页 |
| 2.2.1 RNA提取及cDNA合成 | 第89-90页 |
| 2.2.2 基因克隆及序列分析 | 第90页 |
| 2.2.3 实时定量PCR | 第90页 |
| 2.2.4 蛋白提取和Westernblot分析 | 第90-91页 |
| 2.2.5 亚细胞定位 | 第91页 |
| 2.2.6 酵母单杂(Y1H) | 第91页 |
| 2.2.7 酵母双杂(Y2H) | 第91页 |
| 2.2.8 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第91-92页 |
| 2.2.9 双分子荧光互补实验(BiFC) | 第92页 |
| 2.2.10 烟草瞬时表达及双荧光素酶检测 | 第92-93页 |
| 2.2.11 农杆菌介导的柑橘愈伤组织遗传转化 | 第93页 |
| 2.2.12 农杆菌介导的番茄遗传转化 | 第93页 |
| 2.2.13 转基因材料阳性系的鉴定 | 第93页 |
| 2.2.14 透射电镜(TEM) | 第93页 |
| 2.2.15 类胡萝卜素提取及测定 | 第93-94页 |
| 2.2.16 叶绿素提取及测定 | 第94页 |
| 2.2.17 花青素提取及测定 | 第94-95页 |
| 2.2.18 磷含量提取及测定 | 第95页 |
| 2.2.19 RNA文库构建及测序 | 第95页 |
| 2.2.20 数据分析 | 第95页 |
| 3 转录因子CsMADS6的结果与分析 | 第95-112页 |
| 3.1 CsMADS6基因序列和蛋白特性分析 | 第95-97页 |
| 3.2 CsMADS6基因表达分析 | 第97页 |
| 3.3 CsMADS6蛋白亚细胞定位 | 第97-98页 |
| 3.4 CsMADS6蛋白转录活性分析 | 第98-99页 |
| 3.5 CsMADS6蛋白与LCYb1启动子互作分析 | 第99-101页 |
| 3.5.1 CsMADS6蛋白与LCYb1启动子互作的Y1H验证 | 第99页 |
| 3.5.2 CsMADS6蛋白与LCYb1启动子互作的EMSA验证 | 第99页 |
| 3.5.3 CsMADS6蛋白对LCYb1启动子活性的影响 | 第99-101页 |
| 3.6 柑橘愈伤CsMADS6超表达系类胡萝卜素含量及基因表达分析 | 第101-103页 |
| 3.6.1 柑橘愈伤CsMADS6超表达系的获得和表型分析 | 第101页 |
| 3.6.2 柑橘愈伤CsMADS6超表达系类胡萝卜素含量分析 | 第101页 |
| 3.6.3 柑橘愈伤CsMADS6超表达系类胡萝卜素基因表达分析 | 第101页 |
| 3.6.4 柑橘愈伤CsMADS6超表达系类胡萝卜素相关TFs表达分析 | 第101-103页 |
| 3.7 CsMADS6蛋白与其他类胡萝卜素基因启动子互作分析 | 第103-104页 |
| 3.7.1 CsMADS6蛋白与PSY、PDS和CCD1启动子互作的EMSA验证 | 第103页 |
| 3.7.2 CsMADS6蛋白对PSY、PDS和CCD1启动子活性的影响 | 第103-104页 |
| 3.8 番茄CsMADS6超表达系表型及生理生化分析 | 第104-112页 |
| 3.8.1 番茄CsMADS6超表达系的获得和表型分析 | 第104-106页 |
| 3.8.2 番茄CsMADS6超表达系果皮和萼片类胡萝卜素含量分析 | 第106-107页 |
| 3.8.3 番茄CsMADS6超表达系果皮和萼片质体超微结构分析 | 第107-108页 |
| 3.8.4 番茄CsMADS6超表达系果皮和萼片类胡萝卜素基因表达分析 | 第108-109页 |
| 3.8.5 番茄CsMADS6超表达系萼片RNA-seq全基因组转录水平分析 | 第109-112页 |
| 4 转录因子CsMADS5的结果与分析 | 第112-122页 |
| 4.1 CsMADS5基因序列和表达分析 | 第112-114页 |
| 4.2 CsMADS5蛋白亚细胞定位 | 第114-115页 |
| 4.3 CsMADS5蛋白转录活性分析 | 第115页 |
| 4.4 CsMADS5蛋白与LCYb1启动子互作分析 | 第115-117页 |
| 4.4.1 CsMADS5蛋白与LCYb1启动子互作的Y1H验证 | 第115页 |
| 4.4.2 CsMADS5蛋白与LCYb1启动子互作的EMSA验证 | 第115页 |
| 4.4.3 CsMADS5蛋白对LCYb1启动子活性的影响 | 第115-117页 |
| 4.5 柑橘愈伤CsMADS5超表达系类胡萝卜素含量及基因表达分析 | 第117-119页 |
| 4.5.1 柑橘愈伤CsMADS5超表达系的获得和表型分析 | 第117页 |
| 4.5.2 柑橘愈伤CsMADS5超表达系类胡萝卜素含量分析 | 第117页 |
| 4.5.3 柑橘愈伤CsMADS5超表达系类胡萝卜素基因表达分析 | 第117-119页 |
| 4.6 CsMADS5蛋白与其他类胡萝卜素基因启动子互作分析 | 第119-120页 |
| 4.6.1 CsMADS5蛋白与PSY、PDS和CCD1启动子互作的EMSA验证 | 第119-120页 |
| 4.6.2 CsMADS5蛋白对PSY、PDS和CCD1启动子活性的影响 | 第120页 |
| 4.7 番茄CsMADS5超表达系类胡萝卜素含量及基因表达分析 | 第120-121页 |
| 4.7.1 番茄CsMADS5超表达系的获得和表型分析 | 第120页 |
| 4.7.2 番茄CsMADS5超表达系果实中类胡萝卜素含量分析 | 第120页 |
| 4.7.3 番茄CsMADS5超表达系果实中类胡萝卜素基因表达分析 | 第120-121页 |
| 4.8 CsMADS6与CsMADS5蛋白互作分析 | 第121-122页 |
| 5 转录因子CsGARP4的结果与分析 | 第122-131页 |
| 5.1 CsGARP4基因序列和蛋白特性分析 | 第122-124页 |
| 5.2 CsGARP4基因表达分析 | 第124页 |
| 5.3 CsGARP4蛋白亚细胞定位 | 第124页 |
| 5.4 CsGARP4蛋白转录活性分析 | 第124-126页 |
| 5.5 CsGARP4蛋白与LCYb1启动子互作分析 | 第126-128页 |
| 5.5.1 CsGARP4蛋白与LCYb1启动子互作的Y1H验证 | 第126页 |
| 5.5.2 CsGARP4蛋白与LCYb1启动子互作的EMSA验证 | 第126页 |
| 5.5.3 CsGARP4蛋白对LCYb1启动子活性的影响 | 第126-128页 |
| 5.6 番茄CsGARP4超表达系表型及生理生化分析 | 第128-131页 |
| 5.6.1 番茄CsGARP4超表达系的获得和表型分析 | 第128-129页 |
| 5.6.2 番茄CsGARP4超表达系叶片中CsGARP4及其同源基因表达分析 | 第129页 |
| 5.6.3 番茄CsGARP4超表达系叶片中类胡萝卜素含量及基因表达分析 | 第129-130页 |
| 5.6.4 番茄CsGARP4超表达系叶片中花青素、叶绿素含量及基因表达分析 | 第130页 |
| 5.6.5 番茄CsGARP4超表达系叶片中磷含量及磷饥饿相关基因表达分析 | 第130-131页 |
| 6 讨论 | 第131-139页 |
| 6.1 CsMADS6和CsMADS5是LCYb1直接正调控因子 | 第132页 |
| 6.2 CsMADS6和CsMADS5通过直接调控LCYb1、PSY、PDS和CCD1,从而协同调控类胡萝卜素代谢 | 第132-136页 |
| 6.3 CsMADS6重排转录网络,引导代谢流特异进入类胡萝卜素代谢通路 | 第136-138页 |
| 6.4 CsGARP4可能的转录调控机理 | 第138-139页 |
| 第六章 总结与展望 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-162页 |
| 附录 I 部分实验方法 | 第162-169页 |
| 方法S1 DNA提取 | 第162页 |
| 方法S2 RNA提取 | 第162-163页 |
| 方法S3 cDNA合成 | 第163-164页 |
| 方法S4 qRT-PCR | 第164页 |
| 方法S5 农杆菌感受态制备及转化 | 第164-165页 |
| 方法S6 酵母感受态制备及转化 | 第165-167页 |
| 方法S7 双荧光素酶检测方法 | 第167页 |
| 方法S8 类胡萝卜素提取和测定 | 第167-169页 |
| 附录 Ⅱ部分实验结果 | 第169-191页 |
| 附录 III 博士期间发表论文 | 第191-192页 |
| 致谢 | 第192-193页 |
