| 摘要 | 第5-9页 |
| ABSTRACT | 第9-15页 |
| 第一篇 文献综述 | 第23-50页 |
| 第一章 隐孢子虫概述 | 第23-36页 |
| 1. 隐孢子虫简介 | 第23-33页 |
| 1.2 隐孢子虫分类和遗传多态性 | 第25-33页 |
| 1.2.1 隐孢子虫基因型分类 | 第27-29页 |
| 1.2.2 隐孢子虫亚型分类 | 第29-33页 |
| 2. 隐孢子虫检测方法 | 第33-34页 |
| 3. 野生动物隐孢子虫 | 第34-36页 |
| 第二章 隐孢子虫P23蛋白及乳酸乳球菌抗原呈递系统研究 | 第36-50页 |
| 1. 隐孢子虫P23蛋白 | 第36-43页 |
| 1.1 隐孢子虫致病因子 | 第36-38页 |
| 1.2 微小隐孢子虫P23蛋白相关研究 | 第38-41页 |
| 1.2.1 糖蛋白P23研究 | 第39-40页 |
| 1.2.2 糖蛋白P23疫苗研究 | 第40-41页 |
| 1.3 宿主对隐孢子虫免疫反应 | 第41-43页 |
| 1.3.1 体液免疫反应 | 第41-42页 |
| 1.3.2 细胞免疫反应 | 第42-43页 |
| 2. 乳酸乳球菌抗原呈递系统研究 | 第43-48页 |
| 2.1 肠道黏膜免疫系统及应答 | 第43-44页 |
| 2.1.1 肠道黏膜免疫反应 | 第43-44页 |
| 2.1.2 肠道sIgA作用 | 第44页 |
| 2.2 乳酸乳球菌表达系统 | 第44-48页 |
| 2.2.1 食品级乳酸乳球菌NICE系统优点 | 第45-46页 |
| 2.2.2 乳酸乳球菌抗原呈递系统的应用 | 第46-48页 |
| 3. 目的与意义 | 第48-50页 |
| 第二篇 研究内容 | 第50-132页 |
| 第三章 四川省圈养野生动物隐孢子虫感染调查 | 第50-61页 |
| 引言 | 第50页 |
| 1. 材料与方法 | 第50-56页 |
| 1.1 粪便样品采集 | 第50-52页 |
| 1.2 粪便检测 | 第52-54页 |
| 1.2.1 显微镜检测 | 第52页 |
| 1.2.2 PCR检测 | 第52-54页 |
| 1.3 试验主要试剂 | 第54-55页 |
| 1.4 试验主要设备 | 第55-56页 |
| 2. 试验结果 | 第56-57页 |
| 2.1 显微镜检测结果 | 第56页 |
| 2.2 PCR检测结果 | 第56-57页 |
| 3. 分析与讨论 | 第57-60页 |
| 3.1 野生动物隐孢子虫检测方法 | 第57-59页 |
| 3.2 阳性隐孢子虫感染分析 | 第59-60页 |
| 3.3 宿主特异性分析 | 第60页 |
| 4. 小结 | 第60-61页 |
| 第四章 四川省圈养野生动物隐孢子虫基因型及亚型鉴定 | 第61-91页 |
| 引言 | 第61页 |
| 1. 材料和方法 | 第61-68页 |
| 1.1 隐孢子虫分离株 | 第61-62页 |
| 1.2 主要试剂 | 第62页 |
| 1.3 试剂及培养基配制 | 第62-63页 |
| 1.4 仪器设备 | 第63页 |
| 1.5 动物试验 | 第63页 |
| 1.6 PCR鉴定基因型 | 第63-66页 |
| 1.6.1 基因型PCR扩增 | 第63-65页 |
| 1.6.2 PCR二套产物检测 | 第65页 |
| 1.6.3 actin基因克隆 | 第65-66页 |
| 1.7 PCR鉴定分离株亚型 | 第66-67页 |
| 1.8 PCR产物测序与提交 | 第67-68页 |
| 1.9 核苷酸序列分析 | 第68页 |
| 2. 结果与分析 | 第68-85页 |
| 2.1 PCR扩增结果 | 第68-71页 |
| 2.2 分离株基因鉴定结果 | 第71-85页 |
| 2.2.1 竹鼠源隐孢子虫基因鉴定 | 第71-75页 |
| 2.2.2 骆驼源隐孢子虫基因鉴定 | 第75-77页 |
| 2.2.3 松鼠猴源隐孢子虫基因鉴定 | 第77-82页 |
| 2.2.4 野猪源与小香猪源隐孢子虫基因鉴定 | 第82-85页 |
| 2.3 动物感染结果 | 第85页 |
| 3. 讨论 | 第85-89页 |
| 3.1 野生动物隐孢子虫遗传学研究必要性 | 第85页 |
| 3.2 各分离株基因型与亚型分析 | 第85-89页 |
| 3.2.1 骆驼隐孢子虫基因及生物学特性 | 第85-87页 |
| 3.2.2 竹鼠隐孢子虫基因特性 | 第87-88页 |
| 3.2.3 松鼠猴隐孢子虫基因特性 | 第88-89页 |
| 3.2.4 野猪隐孢子虫基因特性比较 | 第89页 |
| 3.3 宿主适应性分析 | 第89页 |
| 4. 小结 | 第89-91页 |
| 第五章 隐孢子虫食品级乳酸乳球菌疫苗株构建 | 第91-120页 |
| 引言 | 第91页 |
| 1. 试验材料 | 第91-95页 |
| 1.1 微小隐孢子虫病原 | 第91页 |
| 1.2 菌株、质粒及主要试剂 | 第91-93页 |
| 1.3 主要培养基及缓冲液配制 | 第93-95页 |
| 1.3.1 培养基配制 | 第93-94页 |
| 1.3.2 主要试剂配制 | 第94-95页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第95页 |
| 2. 试验与方法 | 第95-103页 |
| 2.1 C.parvum 23基因提取、扩增及纯化 | 第95-98页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第95-96页 |
| 2.1.2 C.parvum总RNA提取 | 第96-97页 |
| 2.1.3 P23 cDNA合成 | 第97页 |
| 2.1.4 P23基因PCR扩增 | 第97-98页 |
| 2.1.5 P23 PCR产物检测与回收 | 第98页 |
| 2.2 目的基因与T载体连接及转化 | 第98-100页 |
| 2.2.1 载体连接 | 第98页 |
| 2.2.2 重组载体鉴定及酶切 | 第98-100页 |
| 2.3 NZ3900感受态制作 | 第100-101页 |
| 2.3.1 制备感受态溶液 | 第100页 |
| 2.3.2 NZ3900菌复苏及感受态制备 | 第100-101页 |
| 2.4 表达载体pNZ8149提取及酶切纯化 | 第101页 |
| 2.4.1 表达载体pNZ8149质粒提取 | 第101页 |
| 2.4.2 pNZ8149质粒双酶切及纯化 | 第101页 |
| 2.5 P23基因乳酸乳球菌食品级工程菌构建 | 第101-103页 |
| 2.5.1 载体pNZ8149及P23双酶切产物连接 | 第101-103页 |
| 2.6 诱导表达P23-pNZ8149/NZ3900 | 第103页 |
| 3. P23基因原核表达工程菌构建 | 第103-105页 |
| 3.1 目的基因原核表达构建 | 第103-104页 |
| 3.1.1 pET-32a载体菌扩增与质粒提取 | 第103-104页 |
| 3.1.2 表达质粒酶切胶回收 | 第104页 |
| 3.1.3 目的片段与表达载体pET-32a连接转化 | 第104页 |
| 3.1.4 重组载体鉴定及阳性克隆子保存 | 第104页 |
| 3.2 目的蛋白原核诱导表达及检测 | 第104-105页 |
| 3.3 一抗制备 | 第105页 |
| 4. P23-pNZ8149/NZ3900目的蛋白免疫活性检测 | 第105-107页 |
| 4.1 Western-blot检测目的蛋白免疫原性 | 第105-106页 |
| 4.2 P23-pNZ8149/NZ3900菌IIF检测 | 第106-107页 |
| 5. 结果分析 | 第107-117页 |
| 5.1 目的基因RT-PCR扩增结果 | 第107页 |
| 5.2 目的基因T克隆及酶切结果 | 第107-109页 |
| 5.3 目的基因T克隆测序结果 | 第109-110页 |
| 5.4 重组乳酸乳球菌构建结果 | 第110-113页 |
| 5.4.1 表达载体pNZ8149质粒鉴定结果 | 第110-111页 |
| 5.4.2 重组乳酸乳球菌电转结果 | 第111页 |
| 5.4.3 重组菌P23-pNZ8149/NZ3900鉴定结果 | 第111-113页 |
| 5.4.5 P23蛋白在P23-pNZ8149/NZ3900含量测定 | 第113页 |
| 5.5 重组大肠杆菌表达系统鉴定结果 | 第113-115页 |
| 5.5.1 重组载体P23-pET32a质粒鉴定结果 | 第113-114页 |
| 5.5.2 目标蛋白在BL21中诱导表达 | 第114-115页 |
| 5.6 P23在P23-pNZ8149/NZ3900中免疫原性鉴定结果 | 第115-117页 |
| 5.6.1 Western-blot鉴定目的蛋白免疫原性结果 | 第115-116页 |
| 5.6.2 IIF鉴定目的蛋白免疫原性结果 | 第116-117页 |
| 6. 讨论 | 第117-119页 |
| 6.1 选择食品级乳酸乳球菌NICE的优势 | 第117-118页 |
| 6.2 隐孢子虫P23蛋白表达 | 第118-119页 |
| 7. 小结 | 第119-120页 |
| 第六章 重组P23-pNZ8149/NZ3900菌株对小鼠免疫指标初步评估 | 第120-132页 |
| 引言 | 第120页 |
| 1. 材料与方法 | 第120-122页 |
| 1.1 试验材料 | 第120-121页 |
| 1.1.1 试验动物及免疫原 | 第120页 |
| 1.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第120-121页 |
| 1.2 主要仪器及溶液 | 第121-122页 |
| 1.2.1 主要仪器 | 第121页 |
| 1.2.2 主要溶液配制 | 第121-122页 |
| 2. 试验方法 | 第122-124页 |
| 2.1 免疫原制备 | 第122页 |
| 2.1.1 P23-pNZ8149/NZ3900免疫原制备 | 第122页 |
| 2.1.2 空载体pNZ8149//NZ3900及PBS制备 | 第122页 |
| 2.2 试验动物分组及免疫方式 | 第122-123页 |
| 2.3 试验动物样品取材及检测 | 第123页 |
| 2.3.1 小鼠抗体样品获取 | 第123页 |
| 2.3.2 小鼠细胞因子样品取材 | 第123页 |
| 2.4 数据分析 | 第123-124页 |
| 3. 结果 | 第124-128页 |
| 3.1 肠粘液与粪便中sIgA与IgM变化 | 第124页 |
| 3.2 血清中IgG,IgA及IgG 1变化 | 第124-125页 |
| 3.3 血清中IL-4,IL-12,TNF-α及IFN-γ变化 | 第125-126页 |
| 3.4 脾脏CD4~+与CD8~+变化 | 第126-127页 |
| 3.5 脾脏IL-4,IL-12,TNF-α及IFN-γ变化 | 第127-128页 |
| 4. 讨论 | 第128-130页 |
| 4.1 黏膜与体液免疫 | 第128-129页 |
| 4.2 细胞因子 | 第129-130页 |
| 4.3 P23-pNZ8149/NZ3900粘附定植 | 第130页 |
| 5. 小结 | 第130-132页 |
| 第三篇 结论与创新 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-146页 |
| 致谢 | 第146-148页 |
| 附录 | 第148-149页 |
| 作者简介 | 第149-151页 |
