| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第12-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 溶菌酶概述 | 第13页 |
| 1.2 溶菌酶的理化性质与分类 | 第13-14页 |
| 1.3 溶菌酶的基因与结构功能 | 第14-15页 |
| 1.4 溶菌酶的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.5 溶菌酶的生物学作用 | 第16-17页 |
| 1.5.1 抗菌消炎作用 | 第16-17页 |
| 1.5.2 抗病毒作用 | 第17页 |
| 1.5.3 重要的非特异性因子 | 第17页 |
| 1.6 溶菌酶的应用 | 第17-18页 |
| 1.6.1 溶菌酶在食品行业中的应用 | 第17页 |
| 1.6.2 溶菌酶在农业领域中的应用 | 第17-18页 |
| 1.6.3 溶菌酶在医药方面的应用 | 第18页 |
| 1.7 人溶菌酶的基因工程研究进展 | 第18-20页 |
| 1.7.1 利用大肠杆菌表达表达人溶菌酶 | 第18-19页 |
| 1.7.2 利用植物表达人溶菌酶 | 第19页 |
| 1.7.3 利用转基因动物表达人溶菌酶 | 第19页 |
| 1.7.4 利用酵母表达人溶菌酶 | 第19-20页 |
| 1.8 毕赤酵母表达系统概述 | 第20-22页 |
| 2 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 3 材料与方法 | 第23-38页 |
| 3.1 试验材料 | 第23-26页 |
| 3.1.1 质粒、载体、酵母细胞和菌株 | 第23页 |
| 3.1.2 工具酶及主要试剂 | 第23页 |
| 3.1.3 相关引物 | 第23-24页 |
| 3.1.4 相关溶液 | 第24-25页 |
| 3.1.4.1 酵母培养基母液 | 第24页 |
| 3.1.4.2 SDS-PAGE缓冲液 | 第24-25页 |
| 3.1.4.3 Western blot缓冲液 | 第25页 |
| 3.1.4.4 其他缓冲液 | 第25页 |
| 3.1.5 常用培养基 | 第25-26页 |
| 3.2 试验方法 | 第26-38页 |
| 3.2.1 重组pPICZαA-Hlys表达载体的构建 | 第26-29页 |
| 3.2.1.1 限制性内切酶酶切反应 | 第26页 |
| 3.2.1.2 酶切产物的回收 | 第26页 |
| 3.2.1.3 回收产物的连接与转化 | 第26-27页 |
| 3.2.1.4 重组质粒的小量制备 | 第27页 |
| 3.2.1.5 重组质粒酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 3.2.1.6 pPICZαA-Hlys重组质粒的大量制备 | 第28-29页 |
| 3.2.2 毕赤酵母的转化 | 第29-30页 |
| 3.2.2.1 质粒线性化 | 第29页 |
| 3.2.2.2 GS115感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| 3.2.2.3 线性化质粒电转化 | 第30页 |
| 3.2.3 重组酵母菌株的筛选 | 第30页 |
| 3.2.4 重组酵母菌株诱导表达SDS-PAGE分析与Western Blotting检测 | 第30-31页 |
| 3.2.4.1 重组酵母菌株诱导表达 | 第30-31页 |
| 3.2.4.2 SDS-PAGE分析表达产物 | 第31页 |
| 3.2.4.3 Western blot分析表达产物 | 第31页 |
| 3.2.5 重组酵母菌摇瓶水平诱导条件的优化 | 第31-32页 |
| 3.2.5.1 重组菌株的优化 | 第31页 |
| 3.2.5.2 诱导时间的优化 | 第31-32页 |
| 3.2.5.3 pH值的优化 | 第32页 |
| 3.2.5.4 甲醇诱导浓度的优化 | 第32页 |
| 3.2.6 重组酵母菌的发酵罐水平诱导表达 | 第32-33页 |
| 3.2.6.1 一级接种的制备 | 第32页 |
| 3.2.6.2 二级接种的制备 | 第32页 |
| 3.2.6.3 上罐准备 | 第32-33页 |
| 3.2.6.4 发酵-甘油批式阶段 | 第33页 |
| 3.2.6.5 发酵-甘油补料阶段 | 第33页 |
| 3.2.6.6 发酵-甲醇诱导阶段 | 第33页 |
| 3.2.6.7 工程菌生长曲线的绘制 | 第33页 |
| 3.2.7 Hlys的生物学活性检测 | 第33-36页 |
| 3.2.7.1 体外抑菌试验 | 第33-34页 |
| 3.2.7.2 MIC和MBC试验 | 第34-35页 |
| 3.2.7.3 溶菌酶活性的测定 | 第35-36页 |
| 3.2.8 小鼠动物试验 | 第36-38页 |
| 3.2.8.1 饲喂日增重试验 | 第36页 |
| 3.2.8.2 菌株的培养 | 第36页 |
| 3.2.8.3 小鼠毒力预试验 | 第36页 |
| 3.2.8.4 Hlys预防治疗链球菌感染试验 | 第36-38页 |
| 4 结果与分析 | 第38-55页 |
| 4.1 Hlys在毕赤酵母中的表达 | 第38-42页 |
| 4.1.1 重组pPICZαA-Hlys表达载体的鉴定 | 第38页 |
| 4.1.2 重组酵母菌株的筛选 | 第38-39页 |
| 4.1.2.1 Zeocin抗性筛选 | 第38页 |
| 4.1.2.2 PCR筛选重组酵母菌株 | 第38-39页 |
| 4.1.3 SDS-PAGE和Western Blotting检测Hlys蛋白的表达 | 第39-40页 |
| 4.1.3.1 SDS-PAGE分析Hlys蛋白的表达 | 第39-40页 |
| 4.1.3.2 Western Blotting检测 | 第40页 |
| 4.1.4 摇瓶水平诱导条件的优化结果与分析 | 第40-42页 |
| 4.1.4.1 诱导菌株的优化 | 第41页 |
| 4.1.4.2 诱导时间的优化 | 第41-42页 |
| 4.1.4.3 诱导pH的优化 | 第42页 |
| 4.1.4.4 诱导甲醇浓度的优化 | 第42页 |
| 4.2 重组Hlys毕赤酵母的发酵研究 | 第42-44页 |
| 4.2.1 重组Hlys毕赤酵母菌的生长曲线 | 第42-43页 |
| 4.2.2 发酵表达Hlys的SDS-PAGE分析 | 第43-44页 |
| 4.3 重组Hlys蛋白的生物学活性检测 | 第44-50页 |
| 4.3.1 发酵表达Hlys蛋白浓度的测定 | 第44页 |
| 4.3.2 重组Hlys的体外抑菌试验 | 第44-48页 |
| 4.3.2.1 对溶壁微球菌的抑菌试验 | 第44-45页 |
| 4.3.2.2 对大肠杆菌分离株的抑菌试验 | 第45页 |
| 4.3.2.3 对金黄色葡萄球菌分离株的抑菌试验 | 第45-46页 |
| 4.3.2.4 对副猪嗜血杆菌分离株的抑菌试验 | 第46页 |
| 4.3.2.5 对胸膜肺炎放线杆菌分离株的抑菌试验 | 第46-47页 |
| 4.3.2.6 对链球菌分离株SC19的抑菌试验 | 第47-48页 |
| 4.3.3 MIC和MBC试验 | 第48-50页 |
| 4.3.3.1 对不同菌的MIC和MBC测定 | 第48页 |
| 4.3.3.2 对链球菌不同株的MIC和MBC测定 | 第48-49页 |
| 4.3.3.3 对副猪嗜血杆菌不同株的MIC和MBC测定 | 第49-50页 |
| 4.4 重组Hlys蛋白酶活力的测定 | 第50-51页 |
| 4.4.1 重组Hlys蛋白的Sephadex G-50凝胶层析柱纯化 | 第50页 |
| 4.4.2 酶活力测定 | 第50-51页 |
| 4.5 动物试验 | 第51-55页 |
| 4.5.1 小鼠日增重试验 | 第51-52页 |
| 4.5.2 攻毒预试验 | 第52页 |
| 4.5.3 Hlys预防治疗链球菌感染试验 | 第52-55页 |
| 5 讨论与结论 | 第55-58页 |
| 5.1 讨论 | 第55-57页 |
| 5.1.1 人溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第55-56页 |
| 5.1.1.1 表达系统的选择和基因的优化 | 第55页 |
| 5.1.1.2 高拷贝重组子的获得 | 第55页 |
| 5.1.1.3 诱导条件的优化 | 第55-56页 |
| 5.1.1.4 发酵过程的控制 | 第56页 |
| 5.1.2 生物学活性和动物试验 | 第56-57页 |
| 5.2 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
