| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-39页 |
| 1.1 生物合成肝素 | 第15-20页 |
| 1.1.1 肝素研究背景 | 第15-16页 |
| 1.1.2 肝素的体内合成途径 | 第16-17页 |
| 1.1.3 体外酶法合成肝素 | 第17-19页 |
| 1.1.4 体外酶法合成超低分子量肝素(ULMWH) | 第19-20页 |
| 1.2 PAPS的合成以及PAPS再生系统的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.2.1 PAPS的酶法合成 | 第21页 |
| 1.2.2 PAPS再生系统 | 第21-22页 |
| 1.3 肝素修饰酶的研究进展 | 第22-28页 |
| 1.3.1 肝素修饰酶的表达情况 | 第22页 |
| 1.3.2 肝素修饰酶的底物特异性 | 第22-25页 |
| 1.3.3 肝素修饰酶的结构 | 第25-28页 |
| 1.4 酶一步纯化与定点固定化研究进展 | 第28-30页 |
| 1.4.1 常用的固定化酶方法 | 第28-29页 |
| 1.4.2 甲酰甘氨酸修饰与酶的固定化 | 第29-30页 |
| 1.5 肝素结构的分析技术 | 第30-32页 |
| 1.6 UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA的合成研究进展 | 第32-38页 |
| 1.6.1 UDP-GlcNAc合成的研究进展 | 第32-35页 |
| 1.6.2 UDP-GlcNTFA合成的研究进展 | 第35-38页 |
| 1.7 本课题的基本思路和研究内容 | 第38-39页 |
| 第二章 材料与方法 | 第39-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第39页 |
| 2.1.2 质粒 | 第39页 |
| 2.1.3 重要试剂、工具酶及试剂盒 | 第39页 |
| 2.1.4 培养基 | 第39-40页 |
| 2.2 试验仪器 | 第40-41页 |
| 2.3 实验及分析方法 | 第41-46页 |
| 2.3.1 分子克隆实验 | 第41-43页 |
| 2.3.2 目标蛋白在大肠杆菌中诱导表达、检测分析及分离纯化 | 第43-46页 |
| 第三章 3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸的酶法合成 | 第46-56页 |
| 3.1 引言 | 第46-47页 |
| 3.2 材料与方法 | 第47-49页 |
| 3.2.1 材料 | 第47页 |
| 3.2.2 方法 | 第47-49页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第49-55页 |
| 3.3.1 ATP硫化酶和APS激酶表达与纯化 | 第49-50页 |
| 3.3.2 PAPS合成条件的优化 | 第50-53页 |
| 3.3.3 最适条件下,不同底物浓度PAPS随时间的积累量变化 | 第53页 |
| 3.3.4 底物fed-batch以提高反应的转化效率 | 第53-54页 |
| 3.3.5 PAPS反应产物的LC-MS验证 | 第54-55页 |
| 3.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 五种肝素修饰酶在大肠杆菌中的重组表达和纯化 | 第56-73页 |
| 4.1 引言 | 第56页 |
| 4.2 实验材料 | 第56页 |
| 4.2.1 菌株及培养基 | 第56页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-58页 |
| 4.3.1 C5异构化酶,2OST,6OST1,6OST3以及3OST1的全基因合成 | 第56-57页 |
| 4.3.2 质粒的构建 | 第57页 |
| 4.3.3 表达重组蛋白 | 第57页 |
| 4.3.4 重组蛋白的纯化 | 第57页 |
| 4.3.5 重组蛋白的脱盐浓缩 | 第57-58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-72页 |
| 4.4.1 肝素修饰酶C5 epimerase,2OST,6OST1,6OST3和3OST的密码子优化 | 第58页 |
| 4.4.2 C5异构化酶的表达与纯化 | 第58-61页 |
| 4.4.3 2OST的表达与纯化 | 第61-63页 |
| 4.4.4 6OST1的表达与纯化 | 第63-65页 |
| 4.4.5 6OST3的表达与纯化 | 第65-68页 |
| 4.4.6 3OST1的表达与纯化 | 第68-71页 |
| 4.4.7 五个酶纯化后浓缩效果 | 第71-72页 |
| 4.5 本章小结 | 第72-73页 |
| 第五章 麦芽糖结合蛋白的甲酰甘氨酸修饰及定点固定化 | 第73-96页 |
| 5.1 引言 | 第73-74页 |
| 5.2 实验材料 | 第74页 |
| 5.2.1 主要试剂 | 第74页 |
| 5.3 实验方法 | 第74-79页 |
| 5.3.1 同源建模以及醛基化标签插入位点的选择 | 第74页 |
| 5.3.2 载体的构建 | 第74-77页 |
| 5.3.3 重组蛋白表达 | 第77页 |
| 5.3.4 一步固定化以及纯化 | 第77-78页 |
| 5.3.5 绿色荧光蛋白荧光量的测定 | 第78页 |
| 5.3.6 精氨酸水解酶酶活的测定 | 第78-79页 |
| 5.4 结果 | 第79-92页 |
| 5.4.1 同源建模以及醛基化标签插入位点的选择 | 第79-82页 |
| 5.4.2 pMAl-mbp-FGE质粒的构建,表达以及一步固定化 | 第82-86页 |
| 5.4.3 GFP的一步纯化以及固定化 | 第86-87页 |
| 5.4.4 精氨酸水解酶的一步纯化以及固定化 | 第87-89页 |
| 5.4.5 固定化精氨酸水解酶的酶学性质 | 第89-92页 |
| 5.5 讨论 | 第92-95页 |
| 5.6 本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 肝素修饰酶的定点固定化及一锅法制备生物肝素 | 第96-107页 |
| 6.1 引言 | 第96页 |
| 6.2 实验材料 | 第96页 |
| 6.3 实验方法 | 第96-99页 |
| 6.3.1 N-sulfo heparosan的制备 | 第96-97页 |
| 6.3.2 表达载体的构建 | 第97页 |
| 6.3.3 表达重组蛋白 | 第97页 |
| 6.3.4 一步固定化以及纯化 | 第97页 |
| 6.3.5 生物合成肝素的制备 | 第97-98页 |
| 6.3.6 定性检测生物合成肝素的生物活性 | 第98页 |
| 6.3.7 血凝仪-APTT法测定肝素的效价 | 第98-99页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第99-105页 |
| 6.4.1 N-solfo heparosan的制备 | 第99-100页 |
| 6.4.2 质粒的构建 | 第100-101页 |
| 6.4.3 C5 epimerase,2OST,6OST1,6OST3,3OST1的固定化 | 第101-103页 |
| 6.4.4 定性测定肝素的抗凝血活性 | 第103-104页 |
| 6.4.5 血凝仪-APTT法定量测定肝素的效价 | 第104-105页 |
| 6.5 本章小结 | 第105-107页 |
| 第七章 肝素的结构鉴定 | 第107-120页 |
| 7.1 引言 | 第107-108页 |
| 7.2 实验材料 | 第108页 |
| 7.3 实验方法 | 第108-109页 |
| 7.3.1 酶水解制备肝素二糖 | 第108页 |
| 7.3.2 使用G-10预装柱处理肝素二糖 | 第108-109页 |
| 7.3.3 SAX-HPLC分析肝素二糖 | 第109页 |
| 7.4 结果与讨论 | 第109-118页 |
| 7.4.1 Hep Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ裂解肝素类物质的最佳时间 | 第109-110页 |
| 7.4.2 G-10预装柱回收肝素裂解二糖的效果 | 第110-111页 |
| 7.4.3 SAX-HPLC分析条件的优化 | 第111-113页 |
| 7.4.4 SAX-HPLC分析肝素二糖 | 第113-118页 |
| 7.5 本章小结 | 第118-120页 |
| 第八章 UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺的化学酶法合成 | 第120-139页 |
| 8.1 引言 | 第120-121页 |
| 8.2 实验材料 | 第121页 |
| 8.2.1 载体与菌株 | 第121页 |
| 8.2.2 主要用酶 | 第121页 |
| 8.3 实验方法 | 第121-127页 |
| 8.3.1 GlcNTFA的化学合成 | 第121页 |
| 8.3.2 引物设计 | 第121页 |
| 8.3.3 大肠杆菌K12(MG1655)以及双歧杆菌基因组的提取 | 第121-122页 |
| 8.3.4 PCR扩增目的基因 | 第122页 |
| 8.3.5 重组表达载体的构建 | 第122-123页 |
| 8.3.6 表达重组蛋白 | 第123页 |
| 8.3.7 目标蛋白分离纯化 | 第123-124页 |
| 8.3.8 NahK、GlmU、PPase酶活的测定 | 第124-126页 |
| 8.3.9 酶法合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA | 第126页 |
| 8.3.10 产物的分析 | 第126-127页 |
| 8.3.11 制备型HPLC分离UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA | 第127页 |
| 8.4 结果与讨论 | 第127-137页 |
| 8.4.1 化学合成GlcNTFA | 第127-128页 |
| 8.4.2 酶的克隆,表达与纯化 | 第128-129页 |
| 8.4.3 酶法合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA | 第129-131页 |
| 8.4.4 不同反应条件对合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA的影响 | 第131-135页 |
| 8.4.5 底物分批补料的放大UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA生产 | 第135-137页 |
| 8.5 本章小结 | 第137-139页 |
| 第九章 结论与展望 | 第139-143页 |
| 9.1 结论 | 第139-141页 |
| 9.2 创新点 | 第141页 |
| 9.3 展望 | 第141-143页 |
| 参考文献 | 第143-153页 |
| 附录 | 第153-161页 |
| 作者简历 | 第161页 |
