摘要 | 第1-10页 |
Abstract | 第10-15页 |
缩略词表 | 第15-16页 |
第一部分 文献综述与实验设计 | 第16-34页 |
第一章 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用 | 第17-22页 |
1 腺相关病毒简介. | 第17-18页 |
2 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用 | 第18-22页 |
·腺相关病毒载体 | 第18-20页 |
·重组腺相关病毒(rAAV)制备的基本原理 | 第18-19页 |
·腺相关病毒载体的特点 | 第19-20页 |
·AAV 载体在基因治疗上的应用 | 第20-22页 |
第二章 腺相关病毒载体(rAAV)生产方式的进展 | 第22-28页 |
1 质粒转染加腺病毒感染的方式 | 第22-23页 |
2 完全采用质粒转染的方式 | 第23页 |
3 采用稳定细胞系的方式. | 第23-25页 |
4 新型rAAV 生产系统:杆状病毒-昆虫细胞生产系统 | 第25-28页 |
第三章 实验设计方案及课题内容 | 第28-34页 |
1 本课题研究目的和意义 | 第28页 |
2 实验设计方案. | 第28-29页 |
3 课题创新点. | 第29-30页 |
4 实验内容及流程图. | 第30-34页 |
第二部分 研究论文 | 第34-82页 |
第一章 重组pFastBacDual 载体的构建及菌内转座重组产生重组 Bacmid | 第35-60页 |
1 实验器材 | 第35-40页 |
·材料 | 第35页 |
·仪器和设备. | 第35-36页 |
·试剂及试剂盒 | 第36页 |
·主要试剂的配制 | 第36-38页 |
·所用引物 | 第38-39页 |
·所用LINKER | 第39-40页 |
2 实验方法 | 第40-51页 |
·重组pFBD 载体构建 | 第40-50页 |
·pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的构建 | 第40-45页 |
·pFBD-AAV2RepiCapi 载体的构建 | 第45-48页 |
·pFBD-AAV2EGFP 载体的构建 | 第48-50页 |
·重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组及重组Bacmid 的提取 | 第50-51页 |
·重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组 | 第50页 |
·重组Bacmid 的大量抽提及PCR 鉴定 | 第50-51页 |
3 结果 | 第51-58页 |
·相关基因或片段的PCR 结果 | 第51-54页 |
·pFBD-AAV2Rep78 及pFBD-AAV2Rep52 的酶切鉴定 | 第54-55页 |
·pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的酶切鉴定 | 第55页 |
·pFBD-AAV2Repi 载体的酶切鉴定 | 第55-56页 |
·pFBD-AAV2RepiCapi 载体的酶切鉴定 | 第56页 |
·pFBD-AAV2EGFP 的酶切鉴定 | 第56页 |
·重组Bacmid 的PCR 鉴定. | 第56-58页 |
4 讨论 | 第58-60页 |
第二章 重组杆状病毒的包装、扩增及滴度测定 | 第60-69页 |
1 实验器材 | 第60-61页 |
·材料与试剂. | 第60页 |
·仪器和设备. | 第60页 |
·荧光定量PCR 引物 | 第60-61页 |
2 实验方法 | 第61-64页 |
·Sf9 细胞的培养 | 第61页 |
·重组杆状病毒的包装 | 第61页 |
·重组杆状病毒的扩增 | 第61-62页 |
·重组杆状病毒DNA 的提取 | 第62页 |
·荧光定量PCR 测定重组杆状病毒的滴度 | 第62-64页 |
·Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定. | 第62-63页 |
·Bac-AAV2EGFP 的滴度测定 | 第63-64页 |
3 结果 | 第64-67页 |
·重组Bacmid 的转染效果 | 第64-65页 |
·重组杆状病毒的滴度测定 | 第65-67页 |
·Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定. | 第65-66页 |
·Bac-AAV2EGFP 的滴度测定 | 第66-67页 |
4 讨论 | 第67-69页 |
第三章 重组 AAV 的生产、纯化、滴度和活力测定 | 第69-82页 |
1 实验器材 | 第69-72页 |
·材料与试剂. | 第69页 |
·仪器和设备. | 第69-70页 |
·试剂的配制 | 第70-72页 |
2 实验方法 | 第72-76页 |
·Western Blot 检测Rep Cap 基因的表达 | 第72-73页 |
·rAAV2-EGFP 的生产 | 第73-74页 |
·rAAV2-EGFP 的三杆状病毒包装系统 | 第73页 |
·rAAV2-EGFP 的二杆状病毒包装系统 | 第73-74页 |
·rAAV2-EGFP 的纯化 | 第74页 |
·滴度测定及生产能力的初步评估 | 第74-75页 |
·病毒基因组滴度测定及生产能力评估 | 第74-75页 |
·转导单位数滴度测定及生产能力评估 | 第75页 |
·病毒活力的检测 | 第75-76页 |
3 结果 | 第76-80页 |
·杆状病毒生产系统Rep Cap 基因表达的Western 检测 | 第76页 |
·rAAV2-EGFP 病毒基因组滴度检测及生产能力的初步评估 | 第76-77页 |
·rAAV2-EGFP 转导单位数滴度检测及生产能力的初步评估 | 第77-79页 |
·病毒活力的检测 | 第79-80页 |
·三杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测 | 第79页 |
·二杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测 | 第79-80页 |
4 讨论 | 第80-82页 |
结论 | 第82-84页 |
参考文献 | 第84-88页 |
在学期间发表的文章 | 第88-89页 |
致谢 | 第89页 |