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重组AAV(rAAV)杆状病毒生产系统的研究

摘要第1-10页
Abstract第10-15页
缩略词表第15-16页
第一部分 文献综述与实验设计第16-34页
 第一章 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用第17-22页
  1 腺相关病毒简介.第17-18页
  2 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用第18-22页
   ·腺相关病毒载体第18-20页
     ·重组腺相关病毒(rAAV)制备的基本原理第18-19页
     ·腺相关病毒载体的特点第19-20页
   ·AAV 载体在基因治疗上的应用第20-22页
 第二章 腺相关病毒载体(rAAV)生产方式的进展第22-28页
  1 质粒转染加腺病毒感染的方式第22-23页
  2 完全采用质粒转染的方式第23页
  3 采用稳定细胞系的方式.第23-25页
  4 新型rAAV 生产系统:杆状病毒-昆虫细胞生产系统第25-28页
 第三章 实验设计方案及课题内容第28-34页
  1 本课题研究目的和意义第28页
  2 实验设计方案.第28-29页
  3 课题创新点.第29-30页
  4 实验内容及流程图.第30-34页
第二部分 研究论文第34-82页
 第一章 重组pFastBacDual 载体的构建及菌内转座重组产生重组 Bacmid第35-60页
  1 实验器材第35-40页
   ·材料第35页
   ·仪器和设备.第35-36页
   ·试剂及试剂盒第36页
   ·主要试剂的配制第36-38页
   ·所用引物第38-39页
   ·所用LINKER第39-40页
  2 实验方法第40-51页
   ·重组pFBD 载体构建第40-50页
     ·pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的构建第40-45页
     ·pFBD-AAV2RepiCapi 载体的构建第45-48页
     ·pFBD-AAV2EGFP 载体的构建第48-50页
   ·重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组及重组Bacmid 的提取第50-51页
     ·重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组第50页
     ·重组Bacmid 的大量抽提及PCR 鉴定第50-51页
  3 结果第51-58页
   ·相关基因或片段的PCR 结果第51-54页
   ·pFBD-AAV2Rep78 及pFBD-AAV2Rep52 的酶切鉴定第54-55页
   ·pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的酶切鉴定第55页
   ·pFBD-AAV2Repi 载体的酶切鉴定第55-56页
   ·pFBD-AAV2RepiCapi 载体的酶切鉴定第56页
   ·pFBD-AAV2EGFP 的酶切鉴定第56页
   ·重组Bacmid 的PCR 鉴定.第56-58页
  4 讨论第58-60页
 第二章 重组杆状病毒的包装、扩增及滴度测定第60-69页
  1 实验器材第60-61页
   ·材料与试剂.第60页
   ·仪器和设备.第60页
   ·荧光定量PCR 引物第60-61页
  2 实验方法第61-64页
   ·Sf9 细胞的培养第61页
   ·重组杆状病毒的包装第61页
   ·重组杆状病毒的扩增第61-62页
   ·重组杆状病毒DNA 的提取第62页
   ·荧光定量PCR 测定重组杆状病毒的滴度第62-64页
     ·Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定.第62-63页
     ·Bac-AAV2EGFP 的滴度测定第63-64页
  3 结果第64-67页
   ·重组Bacmid 的转染效果第64-65页
   ·重组杆状病毒的滴度测定第65-67页
     ·Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定.第65-66页
     ·Bac-AAV2EGFP 的滴度测定第66-67页
  4 讨论第67-69页
 第三章 重组 AAV 的生产、纯化、滴度和活力测定第69-82页
  1 实验器材第69-72页
   ·材料与试剂.第69页
   ·仪器和设备.第69-70页
   ·试剂的配制第70-72页
  2 实验方法第72-76页
   ·Western Blot 检测Rep Cap 基因的表达第72-73页
   ·rAAV2-EGFP 的生产第73-74页
     ·rAAV2-EGFP 的三杆状病毒包装系统第73页
     ·rAAV2-EGFP 的二杆状病毒包装系统第73-74页
   ·rAAV2-EGFP 的纯化第74页
   ·滴度测定及生产能力的初步评估第74-75页
     ·病毒基因组滴度测定及生产能力评估第74-75页
     ·转导单位数滴度测定及生产能力评估第75页
   ·病毒活力的检测第75-76页
  3 结果第76-80页
   ·杆状病毒生产系统Rep Cap 基因表达的Western 检测第76页
   ·rAAV2-EGFP 病毒基因组滴度检测及生产能力的初步评估第76-77页
   ·rAAV2-EGFP 转导单位数滴度检测及生产能力的初步评估第77-79页
   ·病毒活力的检测第79-80页
     ·三杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测第79页
     ·二杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测第79-80页
  4 讨论第80-82页
结论第82-84页
参考文献第84-88页
在学期间发表的文章第88-89页
致谢第89页

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