| 摘要 | 第7-8页 |
| ABSTRACT | 第8页 |
| 第一章 绪论 | 第9-17页 |
| 一 核糖体蛋白以及同源基因的研究 | 第9-11页 |
| 二 真核生物启动子特点 | 第11-13页 |
| 1. 核心元件 | 第11页 |
| 2. 上游启动元件(UPE) | 第11-12页 |
| 3. 远端调控区 | 第12-13页 |
| 3.1 增强子(enhomcer) | 第12页 |
| 3.2 减弱子(dehancer) | 第12页 |
| 3.3 上游激活序列(upstream activating seguences UASs) | 第12页 |
| 3.4 静息子(sisencer) | 第12-13页 |
| 三 同源核糖体蛋白启动子及其结合蛋白的研究 | 第13-15页 |
| 1 启动子序列的分析方法 | 第13-14页 |
| 2 启动子结合蛋白的研究方法 | 第14-15页 |
| 四 本论文研究思路 | 第15-17页 |
| 第二章 粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和-2的启动子序列的研究 | 第17-43页 |
| 第一节 构建含有启动子序列和报告基因的菌株 | 第17-33页 |
| 1 实验材料 | 第17-21页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第17页 |
| 1.2 培养基 | 第17-18页 |
| 1.3 主要试剂器材及来源 | 第18页 |
| 1.4 主要溶液 | 第18-19页 |
| 1.5 引物 | 第19-20页 |
| 1.6 其他材料 | 第20页 |
| 1.7 菌种培养与保藏 | 第20-21页 |
| 2 试验方法 | 第21-30页 |
| 2.1 基因组的提取 | 第21-22页 |
| 2.2 核糖体蛋白L32-1和L32-2的上游序列和报告基因LacZ的克隆 | 第22-26页 |
| 2.3 核糖体蛋白L32-1和L32-2的上游序列和报告基因LacZ的连接到目的载体上 | 第26-29页 |
| 2.4 含有质粒pREP82X-LacZ-X的粟酒裂殖酵母菌株yAS56的构建 | 第29-30页 |
| 3 结果 | 第30-33页 |
| 3.1 PCR扩增片段结果 | 第30-31页 |
| 3.2 目的片段连pMD-18T阳性克隆筛选结果 | 第31页 |
| 3.3 大体系酶切纯化回收片段结果 | 第31-32页 |
| 3.4 目的片段连接到质粒pREP82X-LacZ上筛选阳性克隆的结果 | 第32-33页 |
| 3.5 验证含有上游序列和报告基因的质粒pREP82X是否化转到粟酒裂殖酵母yAS56中 | 第33页 |
| 第二节 通过酶活测定的方法确定启动子序列 | 第33-38页 |
| 1 实验材料 | 第33-35页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第33-34页 |
| 1.2 培养基 | 第34页 |
| 1.3 主要试剂器材及其来源 | 第34-35页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第35页 |
| 2 实验方法 | 第35-37页 |
| 2.1 制备粗酶提取物并通过蛋白定量分析进行酶活力的均一化 | 第35-36页 |
| 2.2 测定酵母β—半乳糖苷酶酶活 | 第36页 |
| 2.3 采用Bradford法测定抽提物中的蛋白浓度 | 第36页 |
| 2.4 计算公式 | 第36-37页 |
| 3 结果 | 第37-38页 |
| 3.1 蛋白标准曲线 | 第37页 |
| 3.2 粟酒裂殖酵母yAS56/pREP82X-LacZ-X的β—半乳糖苷酶酶活 | 第37-38页 |
| 第三节 生物信息学分析启动子 | 第38-41页 |
| 第四节 本章小结 | 第41-43页 |
| 第三章 核糖体蛋白的启动子结合蛋白的研究 | 第43-87页 |
| 第一节 构建粟酒裂殖酵母972H~-CDNA文库 | 第43-59页 |
| 1 实验材料 | 第43-44页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第43页 |
| 1.2 培养基 | 第43页 |
| 1.3 主要试剂和器材 | 第43-44页 |
| 1.4 主要溶液和试剂 | 第44页 |
| 1.5 引物 | 第44页 |
| 2 实验方法 | 第44-55页 |
| 2.1 提取野生型粟酒裂殖酵母972h~-的total RNA | 第45-48页 |
| 2.2 去除总RNA中的DNA | 第48-49页 |
| 2.3 验证DNA去除效果 | 第49-50页 |
| 2.4 mRNA的纯化 | 第50-52页 |
| 2.5 mRNA反转录第一链cDNA SMART cDNA | 第52-53页 |
| 2.6 LD-PCR扩增SMART cDNA | 第53-54页 |
| 2.7 回收ds cDNA | 第54-55页 |
| 3 结果 | 第55-59页 |
| 3.1 RNA的提取情况 | 第55-56页 |
| 3.2 去除总RNA中的DNA | 第56页 |
| 3.3 验证DNA去除效果 | 第56-57页 |
| 3.4 mRNA的纯化 | 第57-58页 |
| 3.5 mRNA反转录第一链cDNA SMART cDNA | 第58页 |
| 3.6 LD-PCR扩增SMART ds cDNA | 第58-59页 |
| 3.7 回收ds cDNA | 第59页 |
| 第二节 构建酵母单杂交体系 | 第59-84页 |
| 1 实验材料 | 第60-63页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第60页 |
| 1.2 培养基 | 第60-61页 |
| 1.3 主要试剂器材及来源 | 第61页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第61-62页 |
| 1.5 引物 | 第62-63页 |
| 2 实验方法 | 第63-76页 |
| 2.1 构建酵母单杂交体系主要步骤 | 第63页 |
| 2.2 构建含有核糖体蛋白L32-1和L32-1启动子序列的pAbAi质粒 | 第63-66页 |
| 2.3 构建诱饵菌株,即将含有启动子的载体(pBait-AbAi)转化到Y1HGold中 | 第66-68页 |
| 2.4 检测含有诱饵质粒的Y1HGold中,AbAr的表达量 | 第68-69页 |
| 2.5 构建完整的酵母单杂交体系 | 第69-70页 |
| 2.6 文库滴度 | 第70-71页 |
| 2.7 挑选阳性克隆提酵母质粒并测序 | 第71-73页 |
| 2.8 验证结果正确性 | 第73页 |
| 2.9 RPL5的克隆及验证 | 第73-76页 |
| 3 结果 | 第76-84页 |
| 3.1 L32启动子诱饵质粒的构建与鉴定 | 第76页 |
| 3.2 双酶切验证阳性克隆 | 第76-77页 |
| 3.3 验证诱饵菌株,即诱饵载体(pBait-AbAi)是否转化至Y1HGold | 第77-78页 |
| 3.4 检测Y1HGold/pAbAi/L32-1和Y1HGold/pAbAi/L32-2的AbAr本底表达量 | 第78-79页 |
| 3.5 酵母CDNA文库的构建及检定 | 第79-81页 |
| 3.6 酵母L32-1、L32-2启动子结合蛋白的筛选与鉴定 | 第81-82页 |
| 3.7 结果的重复验证 | 第82页 |
| 3.8 RPL5的克隆及验证 | 第82-84页 |
| 第三节 本章小结 | 第84-87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
