| 縮略词表 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-32页 |
| 1.1 溶菌酶的研究进展 | 第14-18页 |
| 1.1.1 溶菌酶的简介 | 第14页 |
| 1.1.2 溶菌酶的分类 | 第14页 |
| 1.1.3 溶菌酶的制备 | 第14-15页 |
| 1.1.4 溶菌酶的生物学特性 | 第15-17页 |
| 1.1.5 溶菌酶的应用 | 第17-18页 |
| 1.1.5.1 溶菌酶在食品工业中的应用 | 第17页 |
| 1.1.5.2 溶菌酶在医疗行业中的应用 | 第17-18页 |
| 1.1.5.3 溶菌酶在饲料行业中的应用 | 第18页 |
| 1.2 外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略 | 第18-23页 |
| 1.2.1 宿主与载体的选择 | 第18-21页 |
| 1.2.1.1 选择适合的菌株 | 第18-19页 |
| 1.2.1.2 融合蛋白的表达 | 第19页 |
| 1.2.1.3 分子伴侣的共表达 | 第19-20页 |
| 1.2.1.4 重组蛋白的转运和定位表达 | 第20-21页 |
| 1.2.1.5 启动子的选择 | 第21页 |
| 1.2.1.6 密码子的使用 | 第21页 |
| 1.2.2 优化表达条件 | 第21-23页 |
| 1.2.2.1 化学物质的加入 | 第21-22页 |
| 1.2.2.2 降低培养温度 | 第22页 |
| 1.2.2.3 培养基的组成 | 第22-23页 |
| 1.2.3 改变蛋白结构 | 第23页 |
| 1.3 蛋白分离纯化方法 | 第23-26页 |
| 1.3.1 根据带电性质不同 | 第23-24页 |
| 1.3.1.1 离子交换层析 | 第23-24页 |
| 1.3.1.2 电泳法 | 第24页 |
| 1.3.2 根据蛋白质分子大小不同 | 第24-25页 |
| 1.3.2.1 超滤 | 第24页 |
| 1.3.2.2 凝胶层析 | 第24-25页 |
| 1.3.3 根据配体特异性 | 第25页 |
| 1.3.4 高效液相色谱层析 | 第25页 |
| 1.3.5 分子印迹技术 | 第25-26页 |
| 1.4 包涵体的处理 | 第26-29页 |
| 1.4.1 包涵体的分离 | 第27页 |
| 1.4.2 包涵体的溶解 | 第27页 |
| 1.4.3 包涵体的复性 | 第27-29页 |
| 1.4.3.1 稀释复性 | 第28页 |
| 1.4.3.2 透析复性 | 第28页 |
| 1.4.3.3 超滤复性 | 第28页 |
| 1.4.3.4 凝胶过滤柱上复性 | 第28-29页 |
| 1.4.3.5 对含有二硫键的蛋白复性 | 第29页 |
| 1.5 课题研究的主要内容、目的、意义及技术路线 | 第29-32页 |
| 1.5.1 研究内容 | 第29页 |
| 1.5.2 研究目的 | 第29-30页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第30页 |
| 1.5.4 技术路线 | 第30-32页 |
| 第二章 材料与方法 | 第32-66页 |
| 2.1 海参、牡蛎溶菌酶基因的克隆与序列分析 | 第32-41页 |
| 2.1.1 材料与仪器 | 第32-34页 |
| 2.1.1.1 材料 | 第32页 |
| 2.1.1.2 菌株与质粒 | 第32页 |
| 2.1.1.3 特异引物 | 第32页 |
| 2.1.1.4 主要试剂 | 第32-33页 |
| 2.1.1.5 培养基 | 第33页 |
| 2.1.1.6 常用溶液及缓冲液 | 第33页 |
| 2.1.1.7 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.1.2 方法与步骤 | 第34-41页 |
| 2.1.2.1 总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.1.2.2 引物的设计 | 第35页 |
| 2.1.2.3 RT-PCR | 第35-36页 |
| 2.1.2.4 PCR产物割胶回收 | 第36-37页 |
| 2.1.2.5 连接及重组质粒的转化 | 第37-38页 |
| 2.1.2.6 重组子的鉴定 | 第38-41页 |
| 2.2 重组pET-32a(+)SjLys和pET-32a(+)CgLys在大肠杆菌中的表达研究 | 第41-52页 |
| 2.2.1 材料与仪器 | 第41-44页 |
| 2.2.1.1 质粒与菌株 | 第41页 |
| 2.2.1.2 酶与试剂 | 第41页 |
| 2.2.1.3 培养基 | 第41页 |
| 2.2.1.4 常用溶液及缓冲液 | 第41-43页 |
| 2.2.1.5 主要仪器 | 第43-44页 |
| 2.2.2 方法与步骤 | 第44-52页 |
| 2.2.2.1 重组表达载体的构建 | 第44-46页 |
| 2.2.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第46-49页 |
| 2.2.2.3 重组溶菌酶可溶性表达条件及复性条件优化 | 第49-52页 |
| 2.3 重组pCold-SUMO-SjLys和pCold-SUMO-CgLys在大肠杆菌中的表达研究 | 第52-61页 |
| 2.3.1 材料与仪器 | 第52-53页 |
| 2.3.1.1 质粒与菌株 | 第52页 |
| 2.3.1.2 特异引物 | 第52页 |
| 2.3.1.3 酶与试剂 | 第52-53页 |
| 2.3.1.4 培养基 | 第53页 |
| 2.3.1.5 常用溶液及缓冲液 | 第53页 |
| 2.3.1.6 主要仪器 | 第53页 |
| 2.3.2 方法与步骤 | 第53-61页 |
| 2.3.2.1 引物的设计 | 第53-54页 |
| 2.3.2.2 PCR | 第54页 |
| 2.3.2.3 PCR产物磷酸化 | 第54-55页 |
| 2.3.2.4 质粒pCold-SUMO酶切和去磷酸化 | 第55页 |
| 2.3.2.5 割胶回收 | 第55-56页 |
| 2.3.2.6 平端连接 | 第56页 |
| 2.3.2.7 重组子的鉴定 | 第56-58页 |
| 2.3.2.8 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第58-61页 |
| 2.4 重组溶菌酶结构、功能预测及体外活性测定 | 第61-66页 |
| 2.4.1 材料与仪器 | 第61页 |
| 2.4.1.1 材料与菌株 | 第61页 |
| 2.4.1.2 常用缓冲液及培养基 | 第61页 |
| 2.4.1.3 生物信息学软件及仪器设备 | 第61页 |
| 2.4.2 方法与步骤 | 第61-66页 |
| 2.4.2.1 溶菌酶结构与功能预测 | 第61-64页 |
| 2.4.2.2 重组溶菌酶活力测定 | 第64-66页 |
| 第三章 结果与分析 | 第66-91页 |
| 3.1 SjLys和CgLys基因克隆与序列分析 | 第66-71页 |
| 3.1.1 总RNA质量检测 | 第66页 |
| 3.1.2 RT-PCR扩增成熟肽序列 | 第66-67页 |
| 3.1.3 重组质粒pMD18T-SjLys和pMD18T-CgLys构建与鉴定 | 第67-68页 |
| 3.1.4 重组子序列测定 | 第68-71页 |
| 3.2 SjLys和CgLys基因的表达分析 | 第71-74页 |
| 3.2.1 重组表达载体的鉴定 | 第71页 |
| 3.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第71-73页 |
| 3.2.3 重组蛋白可溶性表达条件优化 | 第73页 |
| 3.2.4 复性条件优化 | 第73-74页 |
| 3.3 SjLys和CgLys基因在pCold-SUMO中表达分析 | 第74-78页 |
| 3.3.1 PCR扩增序列 | 第74-75页 |
| 3.3.2 重组子的菌落PCR鉴定 | 第75页 |
| 3.3.3 重组子的酶切鉴定 | 第75-76页 |
| 3.3.4 重组子序列测定 | 第76-78页 |
| 3.3.5 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第78页 |
| 3.4 溶菌酶结构、功能预测及体外活性测定分析 | 第78-91页 |
| 3.4.1 溶菌酶一级序列分析 | 第79-82页 |
| 3.4.1.1 溶菌酶理化性质 | 第79页 |
| 3.4.1.2 溶菌酶亲疏水性分析 | 第79-81页 |
| 3.4.1.3 跨膜结构预测 | 第81-82页 |
| 3.4.1.4 卷曲螺旋预测 | 第82页 |
| 3.4.2 溶菌酶二级结构预测 | 第82-85页 |
| 3.4.2.1 PredictProtein预测二级结构 | 第82-84页 |
| 3.4.2.2 SOPMA预测二级结构 | 第84-85页 |
| 3.4.3 溶菌酶三级结构预测 | 第85-89页 |
| 3.4.3.1 准确性检验 | 第85-87页 |
| 3.4.3.2 多重序列比对 | 第87页 |
| 3.4.3.3 活性位点的预测 | 第87-89页 |
| 3.4.4 系统发育树的构建 | 第89-90页 |
| 3.4.5 抑菌谱检测 | 第90-91页 |
| 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 附录A | 第100-101页 |
| 附录B | 第101-102页 |
| 附录C | 第102页 |
