| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 角蛋白酶概述 | 第12-15页 |
| 1.1.1 角蛋白酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.1.2 角蛋白酶理化性质 | 第13页 |
| 1.1.3 角蛋白酶的晶体结构和底物特异性 | 第13-15页 |
| 1.2 角蛋白酶的应用 | 第15-16页 |
| 1.3 角蛋白酶的发酵生产 | 第16-19页 |
| 1.3.1 产酶微生物筛选和培养优化 | 第16-18页 |
| 1.3.2 发酵罐水平的角蛋白酶生产 | 第18页 |
| 1.3.3 工程菌高产重组角蛋白酶 | 第18-19页 |
| 1.4 角蛋白酶的分子改造 | 第19页 |
| 1.5 国内外角蛋白酶研究进展 | 第19-20页 |
| 1.6 本论文主要研究内容 | 第20-22页 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 | 第20-21页 |
| 1.6.2 本论文主要研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 产角蛋白酶菌株的筛选和发酵条件研究 | 第22-39页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-25页 |
| 2.2.1 主要培养基、试剂和仪器 | 第22-23页 |
| 2.2.2 菌株筛选 | 第23页 |
| 2.2.3 菌落菌体形态观察 | 第23页 |
| 2.2.4 菌株遗传学鉴定 | 第23页 |
| 2.2.5 扫描电镜和红外光谱观察角蛋白水解情况 | 第23页 |
| 2.2.6 角蛋白酶酶活测定 | 第23-24页 |
| 2.2.7 发酵条件研究 | 第24-25页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第25-37页 |
| 2.3.1 高产角蛋白酶菌株筛选与鉴定 | 第25-27页 |
| 2.3.2 羽毛和羊毛的水解现象 | 第27页 |
| 2.3.3 产角蛋白酶菌株的摇瓶发酵条件研究 | 第27-32页 |
| 2.3.4 发酵罐水平的角蛋白酶发酵条件研究 | 第32-37页 |
| 2.4 本章小结 | 第37-39页 |
| 第三章 角蛋白酶分离纯化、异源表达和理化性质测定 | 第39-59页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 材料与方法 | 第39-45页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第39页 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 | 第39-40页 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 | 第40页 |
| 3.2.4 角蛋白酶纯化 | 第40-41页 |
| 3.2.5 蛋白凝胶电泳、酶谱分析及N端氨基酸测序 | 第41页 |
| 3.2.6 角蛋白酶理化性质测定 | 第41-42页 |
| 3.2.7 热不对称PCR和角蛋白酶基因克隆表达 | 第42-45页 |
| 3.2.8 羽毛和羊毛的酶解 | 第45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-58页 |
| 3.3.1 角蛋白酶的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3.3.2 野生角蛋白酶理化性质测定 | 第46-50页 |
| 3.3.3 多酶协同作用水解角蛋白机制探讨 | 第50页 |
| 3.3.4 角蛋白酶基因的分离与测定 | 第50-53页 |
| 3.3.5 角蛋白酶在大肠杆菌中的异源表达 | 第53-54页 |
| 3.3.6 重组角蛋白酶酶学性质分析 | 第54-58页 |
| 3.4 本章小结 | 第58-59页 |
| 第四章 角蛋白酶C端部分缺失突变和功能解析 | 第59-75页 |
| 4.1 引言 | 第59页 |
| 4.2 材料与方法 | 第59-61页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第59页 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 | 第59页 |
| 4.2.3 DNA操作 | 第59-60页 |
| 4.2.4 培养基和培养条件 | 第60页 |
| 4.2.5 不同角蛋白酶突变体的纯化 | 第60页 |
| 4.2.6 角蛋白酶理化性质测定 | 第60-61页 |
| 4.2.7 角蛋白酶模型构建 | 第61页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第61-74页 |
| 4.3.1 角蛋白酶C端结构自我溶解特性 | 第61-62页 |
| 4.3.2 角蛋白酶KerSMD结构模型预测及C端序列分析 | 第62-64页 |
| 4.3.3 角蛋白酶KerSMD的C端部分缺失和突变体构建 | 第64-66页 |
| 4.3.4 C端结构缺失对角蛋白酶理化性质的影响 | 第66-72页 |
| 4.3.5 C端缺失突变体的 3D结构模拟和分析 | 第72-74页 |
| 4.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 第五章 结构域重组提高角蛋白酶催化活性和热稳定性 | 第75-89页 |
| 5.1 引言 | 第75页 |
| 5.2 材料与方法 | 第75-77页 |
| 5.2.1 菌种和质粒 | 第75页 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 | 第75页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第75-76页 |
| 5.2.4 不同角蛋白酶突变体的构建和纯化 | 第76页 |
| 5.2.5 角蛋白酶理化性质测定 | 第76-77页 |
| 5.2.6 同源建模和分子动力学分析 | 第77页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第77-88页 |
| 5.3.1 角蛋白酶突变体的构建、纯化以及蛋白电泳分析 | 第77-80页 |
| 5.3.2 角蛋白酶突变体的酶催化活性及反应动力学参数 | 第80-82页 |
| 5.3.3 温度和pH对角蛋白酶突变体的影响 | 第82-84页 |
| 5.3.4 角蛋白酶突变体二级结构测定和三级结构模拟分析 | 第84-87页 |
| 5.3.5 N端前导肽在角蛋白酶中的功能探索 | 第87-88页 |
| 5.4 本章小结 | 第88-89页 |
| 第六章 角蛋白酶S1口袋分子改造以及大肠杆菌中的发酵研究 | 第89-106页 |
| 6.1 引言 | 第89页 |
| 6.2 材料与方法 | 第89-91页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第89页 |
| 6.2.2 主要试剂和仪器 | 第89-90页 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 | 第90页 |
| 6.2.4 不同角蛋白酶突变体的构建和纯化 | 第90页 |
| 6.2.5 角蛋白酶理化性质测定 | 第90-91页 |
| 6.2.6 同源建模和分子动力学分析 | 第91页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第91-104页 |
| 6.3.1 口袋区域结构分析与关键氨基酸位点选择 | 第91-92页 |
| 6.3.2 S1口袋中的第一轮定点突变 | 第92-94页 |
| 6.3.3 位点Tyr215的非极性氨基酸突变 | 第94-96页 |
| 6.3.4 三个位点Ser180，Glu208和Tyr215的组合突变 | 第96-98页 |
| 6.3.5 突变体热稳定性和蛋白结构模拟分析 | 第98-101页 |
| 6.3.6 角蛋白酶突变体S180G/Y215S在大肠杆菌中的发酵条件研究 | 第101-104页 |
| 6.4 本章小结 | 第104-106页 |
| 主要结论与展望 | 第106-108页 |
| 主要结论 | 第106-107页 |
| 展望 | 第107-108页 |
| 论文主要创新点 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-123页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第123页 |
