| 中文摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的和意义 | 第12-21页 |
| 第一节 无乳链球菌的研究进展 | 第12-20页 |
| 1. 无乳链球菌的分类及生物学特性 | 第12页 |
| 2. 无乳链球菌的特征结构 | 第12-13页 |
| 3. 无乳链球菌的致病性 | 第13-14页 |
| ·对水产动物的致病性 | 第13-14页 |
| ·对人的致病性 | 第14页 |
| 4. 无乳链球菌的致病机制 | 第14-15页 |
| 5. 无乳链球菌的毒力因子 | 第15-20页 |
| ·多糖类 | 第15-18页 |
| ·荚膜多糖寡糖重复单位的结构 | 第16-17页 |
| ·荚膜多糖的合成 | 第17页 |
| ·荚膜多糖合成相关基因 | 第17-18页 |
| ·肽聚糖 | 第18页 |
| ·脂磷壁酸 | 第18页 |
| ·溶血素 | 第18-19页 |
| ·表面蛋白 | 第19-20页 |
| ·Alp蛋白家族 | 第19页 |
| ·β蛋白 | 第19页 |
| ·C5a肽酶 | 第19-20页 |
| ·Lmb蛋白 | 第20页 |
| ·Sip蛋白 | 第20页 |
| ·FbsA蛋白 | 第20页 |
| 第二节 选题的目的与意义 | 第20-21页 |
| 第二部分 试验研究 | 第21-74页 |
| 第一节 无乳链球菌cpsE基因的分子特性分析 | 第21-39页 |
| 1. 材料与方法 | 第22-23页 |
| ·材料 | 第22页 |
| ·菌株 | 第22页 |
| ·主要生物信息学分析软件 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-23页 |
| ·核酸序列的分子特性分析 | 第22页 |
| ·蛋白质序列的分子特性分析 | 第22-23页 |
| 2. 结果 | 第23-36页 |
| ·核酸序列的分子特性分析 | 第23页 |
| ·蛋白质序列的分子特性分析 | 第23-31页 |
| ·无乳链球菌cpsE的密码子偏爱性分析 | 第31-35页 |
| ·无乳链球菌cpsE基因稀有密码子 | 第35-36页 |
| 3. 讨论 | 第36-39页 |
| ·生物信息学的应用 | 第36-37页 |
| ·cpsE基因的分子特性分析 | 第37-38页 |
| ·密码子偏爱性对蛋白表达的影响 | 第38-39页 |
| 第二节 无乳链球菌cpsE基因的原核表达及多克隆抗体制备 | 第39-63页 |
| 1. 材料 | 第39-43页 |
| ·菌株/载体 | 第39-40页 |
| ·实验动物 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40-41页 |
| ·主要溶液配制 | 第41-43页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第41页 |
| ·细菌培养相关溶液 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE电泳相关溶液 | 第41-42页 |
| ·分离His标签重组蛋白包涵体溶液 | 第42-43页 |
| ·Western-blot相关溶液 | 第43页 |
| ·主要仪器设备 | 第43页 |
| 2. 实验方法 | 第43-51页 |
| ·无乳链球菌cpsE基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·引物设计 | 第43-44页 |
| ·cpsE基因的PCR扩增 | 第44页 |
| ·cpsE基因的T克隆与鉴定 | 第44-47页 |
| ·cpsE基因的T克隆构建路线(图6) | 第44-45页 |
| ·cpsE基因的T克隆 | 第45-46页 |
| ·重组克隆质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| ·cpsE基因重组质粒表达菌株的构建 | 第47-49页 |
| ·cpsE表达质粒的构建(图7) | 第47-48页 |
| ·重组克隆质粒pMD19-T-cpsE及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收 | 第48页 |
| ·酶切回收产物pET-32a(+)与cpsE基因片段的连接 | 第48页 |
| ·重组表达质粒转化感受态细胞DH5a | 第48-49页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第49页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及条件优化 | 第49-50页 |
| ·重组蛋白在菌体中的分布及诱导温度的优化 | 第49页 |
| ·IPTG浓度优化 | 第49页 |
| ·诱导时间的优化 | 第49-50页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第50页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第50页 |
| ·过柱纯化重组蛋白 | 第50页 |
| ·兔抗CpsE多克隆抗体的制备 | 第50-51页 |
| ·免疫家兔计划 | 第50-51页 |
| ·Western-blot检测抗体特异性 | 第51页 |
| ·琼脂扩散试验检测兔抗CpsE抗体效价 | 第51页 |
| ·兔抗CpsE IgG的纯化及鉴定 | 第51页 |
| ·粗提兔抗CpsE的IgG | 第51页 |
| 3. 结果 | 第51-59页 |
| ·cpsE基因的扩增和T克隆鉴定 | 第51-53页 |
| ·重组表达质粒pET-32a(+)-cpsE鉴定 | 第53-54页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第54-57页 |
| ·重组蛋白表达的分布及诱导温度优化 | 第54-55页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第55-56页 |
| ·诱导时间的优化 | 第56-57页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第57-58页 |
| ·免疫兔血清的Western-blot检测 | 第58页 |
| ·兔抗CpsE血清琼脂扩散试验效价的检测 | 第58-59页 |
| 4. 讨论 | 第59-63页 |
| ·cpsE基因引物设计和T克隆 | 第59页 |
| ·外源基因的融合表达 | 第59-61页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第61页 |
| ·包涵体的形成 | 第61-62页 |
| ·抗血清的制备及纯化 | 第62-63页 |
| 第三节 无乳链球菌在小鼠组织器官的分布规律研究 | 第63-74页 |
| 1. 实验材料 | 第63-66页 |
| ·试验用菌株 | 第63页 |
| ·试验动物 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·主要仪器 | 第63-64页 |
| ·相关溶液配制 | 第64-66页 |
| ·储备液 | 第64-65页 |
| ·预杂交液 | 第65-66页 |
| ·杂交液 | 第66页 |
| ·BCIP/NBT显色液 | 第66页 |
| 2. 实验方法 | 第66-70页 |
| ·菌株的复苏和稀释 | 第66页 |
| ·人工感染和样品收集 | 第66-67页 |
| ·引物及特异性探针的设计和合成 | 第67-68页 |
| ·稀释探针 | 第68页 |
| ·间接原位PCR方法的建立 | 第68-70页 |
| ·切片 | 第68页 |
| ·预处理 | 第68页 |
| ·原位扩增 | 第68-69页 |
| ·原位杂交的反应条件优化 | 第69页 |
| ·原位杂交 | 第69-70页 |
| ·杂交后洗涤 | 第70页 |
| ·封闭和特化处理 | 第70页 |
| ·显色 | 第70页 |
| ·结果判定 | 第70页 |
| 3. 结果与分析 | 第70-72页 |
| 4. 讨论 | 第72-74页 |
| ·间接原位PCR的应用 | 第72-73页 |
| ·无乳链球菌在小鼠体内的分布 | 第73-74页 |
| 附图及说明 | 第74-79页 |
| 参考文献 | 第79-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 作者攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第92页 |
