| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-28页 |
| ·概述 | 第15-16页 |
| ·ADAM 家族蛋白的国内外研究进展 | 第16-25页 |
| ·ADAM 家族的结构特点和生物功能 | 第16-17页 |
| ·ADAM 家族与肿瘤发生的相关性 | 第17-19页 |
| ·ADAM 家族蛋白的作用机制 | 第19-21页 |
| ·ADAM 家族蛋白的重组表达 | 第21-22页 |
| ·ADAM15 的研究概述 | 第22-25页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第25-28页 |
| ·ADAM15 研究中存在问题 | 第25页 |
| ·本研究的主要内容 | 第25-28页 |
| 第二章 重组人ADAM15 去整合素结构域蛋白的制备 | 第28-38页 |
| ·前言 | 第28页 |
| ·实验材料、仪器 | 第28-29页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·实验仪器 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-31页 |
| ·CaCl_2 法制备感受态细胞 | 第29-30页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第30页 |
| ·表达质粒pGEX-ADAM15 的构建 | 第30页 |
| ·突变表达质粒pGEX-Δ-ADAM15 的构建 | 第30页 |
| ·融合蛋白GST-ADAM15 的诱导表达和纯化 | 第30-31页 |
| ·融合蛋白GST-ADAM15 的表达条件优化 | 第31页 |
| ·融合蛋白GST-ADAM15 的制备 | 第31页 |
| ·rhddADAM15 蛋白的纯化和鉴定 | 第31页 |
| ·结果 | 第31-36页 |
| ·ADAM15 去整合素cDNA 的密码子分析及其在E. coli BL 21 中表达 | 第31-32页 |
| ·pGEX-ADAM15 在E. coli Rosetta(DE3)中表达和条件优化 | 第32-33页 |
| ·pGEX-Δ-ADAM15 在E. coli Rosetta(DE3)中表达 | 第33-34页 |
| ·融合蛋白GST-ADAM15 的凝血酶消化 | 第34-35页 |
| ·rhddADAM15 的鉴定 | 第35-36页 |
| ·讨论 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-38页 |
| 第三章 rhddADAM15 对黑色素瘤细胞作用的研究 | 第38-48页 |
| ·前言 | 第38页 |
| ·实验材料、仪器 | 第38-39页 |
| ·实验材料 | 第38-39页 |
| ·实验仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-41页 |
| ·细胞培养 | 第39页 |
| ·MTT 法测定rhddADAM15 对细胞增殖的抑制 | 第39-40页 |
| ·细胞粘附试验 | 第40页 |
| ·细胞迁移试验 | 第40页 |
| ·细胞侵袭试验 | 第40-41页 |
| ·rhddADAM15 对细胞周期分布的影响 | 第41页 |
| ·实验结果 | 第41-46页 |
| ·rhddADAM15 抑制肿瘤细胞及内皮细胞的生长 | 第41-42页 |
| ·rhddADAM15 抑制 B16 细胞的粘附 | 第42页 |
| ·rhddADAM15 抑制 B16 细胞的迁移和侵袭 | 第42-44页 |
| ·rhddADAM15 对 B16 细胞活力的影响 | 第44页 |
| ·rhddADAM15 对 B16 的细胞周期的影响 | 第44-46页 |
| ·讨论 | 第46-47页 |
| ·小结 | 第47-48页 |
| 第四章 筛选 rhddADAM15 与黑色素瘤细胞作用的靶点蛋白质 | 第48-62页 |
| ·前言 | 第48-49页 |
| ·实验材料、仪器 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| ·实验仪器 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-52页 |
| ·流式细胞术(FCM)检测 rhddADAM15 与 B16 细胞的结合 | 第49-50页 |
| ·制备黑色素瘤细胞(B16)裂解蛋白质 | 第50页 |
| ·Western 杂交检测 rhddADAM15 与 B16 全细胞蛋白的结合 | 第50页 |
| ·亲和甄别磁珠筛选rhddADAM15 结合蛋白质 | 第50-51页 |
| ·电泳分析rhddADAM15 的结合蛋白质 | 第51页 |
| ·电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)测序 | 第51-52页 |
| ·rhddADAM15 与其结合蛋白质的相互作用模式研究 | 第52页 |
| ·实验结果 | 第52-59页 |
| ·流式细胞术(FCM) | 第52-54页 |
| ·Western 杂交检测 rhddADAM15 与 B16 全细胞蛋白的结合 | 第54页 |
| ·SDS-PAGE 分析rhddADAM15 的结合蛋白 | 第54-55页 |
| ·2DE 分析rhddADAM15 的结合蛋白 | 第55页 |
| ·特异结合蛋白质点的质谱(LC-ESI-MS/MS)鉴定 | 第55-57页 |
| ·rhddADAM15 与p38 激酶的相互作用模式研究 | 第57-59页 |
| ·讨论 | 第59-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 第五章 噬菌体展示技术分析 rhddADAM15 的结合肽 | 第62-75页 |
| ·前言 | 第62-63页 |
| ·实验材料、仪器 | 第63-64页 |
| ·实验材料、试剂 | 第63页 |
| ·主要溶液配制方法 | 第63-64页 |
| ·实验仪器 | 第64页 |
| ·实验方法 | 第64-67页 |
| ·生物素化rhddADAM15 的制备 | 第64页 |
| ·生物素化rhddADAM15 的检测 | 第64-65页 |
| ·噬菌体随机肽库淘洗rhddADAM15 的结合肽 | 第65-66页 |
| ·滴度测定（梯度稀释法） | 第66页 |
| ·噬菌体单克隆的挑选与扩增 | 第66页 |
| ·噬菌体DNA 的抽提和序列测定 | 第66-67页 |
| ·ELISA 方法鉴定淘洗得到的噬菌体单克隆的阳性率 | 第67页 |
| ·实验结果 | 第67-72页 |
| ·b-rhddADAM15 紫外扫描图谱分析 | 第67-68页 |
| ·b-rhddADAM15 的ELISA 法检测 | 第68页 |
| ·噬菌体随机肽库对生物素化rhddADAM15 的淘选结果 | 第68-69页 |
| ·噬菌体DNA 的抽提以及插入序列的测序 | 第69-70页 |
| ·十二肽序列分析 | 第70-71页 |
| ·ELISA 验证噬菌体单克隆与rhddADAM15 的结合状况 | 第71页 |
| ·十二肽序列在蛋白质数据中的比对分析(BLAST) | 第71-72页 |
| ·讨论 | 第72-73页 |
| ·小结 | 第73-75页 |
| 第六章 rhddADAM15 靶点蛋白的验证 | 第75-86页 |
| ·前言 | 第75页 |
| ·实验材料、仪器 | 第75-76页 |
| ·实验方法 | 第76-78页 |
| ·离体下检测rhddADAM15 与p38 激酶的相互作用 | 第76-77页 |
| ·rhddADAM15 作用后 B16 细胞 p38 激酶活性测定 | 第77页 |
| ·免疫细胞化学法检测 rhddADAM15 在 B16 胞内的分布 | 第77-78页 |
| ·SB203580 干预下 rhddADAM15 对 B16 细胞增殖的作用 | 第78页 |
| ·SB203580 干预下 rhddADAM15 对 B16 细胞周期的作用 | 第78页 |
| ·实验结果 | 第78-84页 |
| ·离体条件下rhddADAM15 与重组p38 激酶结合的点杂交检测 | 第78-79页 |
| ·离体条件下rhddADAM15 对p38 激酶活性的影响 | 第79-80页 |
| ·rhddADAM15 在 B16 细胞内的分布 | 第80-82页 |
| ·rhddADAM15 对 B16 细胞中 p38 激酶活性的影响 | 第82页 |
| ·SB203580 对 rhddADAM15 抑制 B16 细胞增殖的影响 | 第82-83页 |
| ·SB203580 对 rhddADAM15 作用下 B16 细胞周期的影响 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-85页 |
| ·小结 | 第85-86页 |
| 主要结论 | 第86-88页 |
| 论文创新点 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-105页 |
| 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第105-106页 |
| 附录Ⅱ：质谱序列分析图谱 | 第106-112页 |
