| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 List of Abbreviation | 第9-11页 |
| 文献综述 | 第11-18页 |
| 1 肿瘤坏死因子的研究概况 | 第11-13页 |
| ·肿瘤坏死因子的研究简史 | 第11页 |
| ·肿瘤坏死因子的理化特性 | 第11页 |
| ·TNF-α的分子结构和基因序列 | 第11-12页 |
| ·TNF-α生物学活性 | 第12-13页 |
| ·TNF-α的分布 | 第13页 |
| 2 TNF-α与肝损伤类疾病 | 第13-14页 |
| ·TNF-α在肝损伤中的作用及其机制 | 第13-14页 |
| 3 TNF-α的应用 | 第14-16页 |
| ·TNF-α在抗肿瘤方面的应用 | 第14-15页 |
| ·改造TNF-α的分子结构 | 第14-15页 |
| ·具有TNF-α抗瘤活性和靶细胞专一性的融合蛋白 | 第15页 |
| ·免疫佐剂 | 第15-16页 |
| 4 肿瘤坏死因子α的检测方法 | 第16-18页 |
| ·生物活性检测法 | 第16页 |
| ·免疫学检测方法 | 第16-17页 |
| ·分子生物学检测方法 | 第17-18页 |
| 研究的目的及意义 | 第18-19页 |
| 材料与方法 | 第19-35页 |
| 1 材料 | 第19-23页 |
| ·试验材料 | 第19-21页 |
| ·质粒及菌株 | 第19页 |
| ·病料 | 第19-20页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第20-21页 |
| ·实验动物及抗原 | 第21页 |
| ·主要仪器设备 | 第21页 |
| ·主要溶液及其配制 | 第21-23页 |
| ·培养基相关溶液 | 第21-22页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液 | 第22页 |
| ·Western-blot相关溶液 | 第22页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第22-23页 |
| 2 方法 | 第23-35页 |
| ·鸭肿瘤坏死因子的克隆与鉴定 | 第23-28页 |
| ·引物的设计与合成 | 第23页 |
| ·鸭脾脏总RNA的提取 | 第23-24页 |
| ·RT-PCR扩增及检测 | 第24页 |
| ·RT-PCR产物的回收与纯化 | 第24-25页 |
| ·RT-PCR产物与pMD18-T载体的连接 | 第25页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第25-26页 |
| ·连接产物的转化 | 第26-27页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第28页 |
| ·序列测定 | 第28页 |
| ·基因组序列分析 | 第28页 |
| ·鸭肿瘤坏死因子的表达 | 第28-32页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·带有粘性末端的TNF-α基因片段和载体pET-32a(+)的制备 | 第28-29页 |
| ·TNF-α基因与载体pET-32a(+)的连接 | 第29页 |
| ·重组阳性质粒的筛选与鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pET-32a-TNF-α的酶切鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第30页 |
| ·重组表达质粒在E.coli BL21(DE3)菌中的诱导表达及检测 | 第30页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第30-31页 |
| ·Western-blot分析 | 第31页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第31-32页 |
| ·兔抗鸭TNFα多克隆抗体的制备 | 第32-33页 |
| ·抗原的制备及纯化 | 第32页 |
| ·透析袋的处理 | 第32页 |
| ·包涵体的制备 | 第32页 |
| ·包涵体的纯化与复性 | 第32页 |
| ·免疫原的乳化 | 第32页 |
| ·家兔的免疫 | 第32-33页 |
| ·间接ELISA方法检测抗血清效价 | 第33页 |
| ·收集抗血清 | 第33页 |
| ·鸭肝炎病毒感染鸭肝组织中TNF-α的SABC检测方法的建立 | 第33-35页 |
| ·SABC法的操作步骤 | 第33-34页 |
| ·最佳一抗工作浓度的确定 | 第34页 |
| ·最佳抗原修复方法的确定 | 第34页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第34-35页 |
| 结果与分析 | 第35-42页 |
| 1.鸭TNF-α基因的克隆与鉴定 | 第35页 |
| ·鸭TNF-α基因序列PCR扩增结果 | 第35页 |
| ·目的片段的克隆及鉴定 | 第35页 |
| 2 序列测定及分析 | 第35-37页 |
| ·序列测定结果及推导的氨基酸序列 | 第35-36页 |
| ·与其它种属TNF-α核苷酸序列及氨基酸序列的比较 | 第36-37页 |
| 3 重组表达质粒的构建与鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第37页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第37-38页 |
| 4 表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 | 第38页 |
| ·TNF-α蛋白的表达及SDS-PAGE分析 | 第38页 |
| ·重组TNF-α蛋白的Western-blot分析 | 第38页 |
| ·重组蛋白TNF-α的可溶性分析 | 第38页 |
| 5 免疫兔血清效价的测定结果 | 第38-40页 |
| 6 SABC法检测鸭TNF-α最佳试验条件的确定 | 第40-41页 |
| ·一抗最佳工作浓度的确定 | 第40页 |
| ·最佳抗原修复方法的确定 | 第40页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第40-41页 |
| 7 鸭肿瘤坏死因子α蛋白在鸭肝脏组织中的分布 | 第41-42页 |
| 讨论 | 第42-45页 |
| 1 细胞因子的克隆 | 第42页 |
| 2 重组表达质粒pET-32a-TNF-α在E.ColiBL21中的诱导表达 | 第42-43页 |
| 3 动物的免疫 | 第43页 |
| 4 肿瘤坏死因子在肝组织中的定位 | 第43-45页 |
| 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-52页 |
| 致谢 | 第52页 |
