| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 缩写 | 第11-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-48页 |
| 一、黄鳝是研究性别发育机制的重要模式生物 | 第16-23页 |
| 1. 黄鳝的分类和分布 | 第17页 |
| 2. 黄鳝的生物学习性 | 第17页 |
| 3. 黄鳝的基因组特征及其进化状态 | 第17-18页 |
| 4. 黄鳝是一个研究性别决定的重要模式生物 | 第18-20页 |
| 5. 黄鳝的性别发育与激素相关 | 第20页 |
| 6. 涉及黄鳝性逆转的基因 | 第20-23页 |
| 二、雄性激素受体(AR)基因在雄性发育中的作用 | 第23-40页 |
| 1. 核受体基因家族 | 第23-26页 |
| ·核受体的结构 | 第24-25页 |
| ·核受体的分类 | 第25-26页 |
| 2. 雄性激素 | 第26-28页 |
| ·雄性激素分类 | 第26页 |
| ·雄性激素在雄性发育中的作用 | 第26-28页 |
| 3. 雄性激素受体 | 第28-40页 |
| ·雄性激素受体的结构 | 第29-30页 |
| ·雄性激素受体的作用机制 | 第30-32页 |
| ·雄性激素受体与疾病 | 第32-35页 |
| ·鱼类雄性激素受体 | 第35-38页 |
| ·雄性激素受体在性腺中的表达 | 第38-39页 |
| ·雄性激素受体LBD结构域结构分析 | 第39-40页 |
| 三、蛋白质的核质运输 | 第40-46页 |
| 1. 核孔复合体 | 第41页 |
| 2. 核定位信号序列 | 第41-42页 |
| 3. 蛋白质的核输入机制 | 第42页 |
| 4. 核输出信号序列 | 第42-44页 |
| 5. 蛋白质的核输出机制 | 第44-46页 |
| 四、本论文研究的目的和意义 | 第46-48页 |
| 第二章:黄鳝AR基因的克隆和表达分析 | 第48-80页 |
| 一、简介 | 第48-49页 |
| 二、材料 | 第49-51页 |
| 1. 实验动物 | 第49页 |
| 2. 菌株 | 第49页 |
| 3. 主要试剂和试剂盒 | 第49-50页 |
| 4. 试剂配方 | 第50页 |
| 5. AR基因克隆引物 | 第50-51页 |
| 三、方法 | 第51-68页 |
| 1. 总RNA和mRNA的提取 | 第51-53页 |
| 2. SMART cDNA的合成 | 第53-54页 |
| 3. 兼并PCR克隆黄鳝AR基因保守区域 | 第54-57页 |
| 4. 第二次兼并PCR克隆黄鳝AR基因N端 | 第57页 |
| 5. RACE方法获得黄鳝AR基因全长 | 第57-60页 |
| 6. 黄鳝AR基因全长引物验证 | 第60-61页 |
| 7. 序列分析及进化树的构建 | 第61页 |
| 8. Northern杂交 | 第61-63页 |
| 9. RT-PCR | 第63-64页 |
| 10. 荧光定量PCR | 第64页 |
| 11. 性腺组织mRNA原位杂交 | 第64-68页 |
| 四、结果 | 第68-78页 |
| 1. 黄鳝AR基因的克隆和聚类分析 | 第68-75页 |
| ·黄鳝AR基因的克隆 | 第68-70页 |
| ·黄鳝AR基因的序列分析和进化树构建 | 第70-74页 |
| ·黄鳝AR蛋白的进化树构建 | 第74-75页 |
| 2. 黄鳝AR基因表达模式 | 第75-78页 |
| ·Northern杂交 | 第75页 |
| ·黄鳝AR基因的表达量存在明显的性别差异 | 第75-77页 |
| ·AR基因在性腺中的表达定位 | 第77-78页 |
| 五、讨论 | 第78-80页 |
| 1. 黄鳝AR基因的进化保守性 | 第78页 |
| 2. 黄鳝AR基因的表达模式分析 | 第78-80页 |
| 第三章:黄鳝AR蛋白的核定位信号 | 第80-98页 |
| 一、简介 | 第80-82页 |
| 二、材料 | 第82页 |
| 1. 质粒、菌种 | 第82页 |
| 2. 细胞系 | 第82页 |
| 3. 主要试剂和试剂盒 | 第82页 |
| 三、方法 | 第82-91页 |
| 1. 荧光表达载体的构建 | 第82-87页 |
| ·AR全长cDNA序列,缺失突变体和定点突变体的引物设计 | 第82-84页 |
| ·野生型融合荧光蛋白表达载体以及缺失突变体的构建 | 第84-85页 |
| ·定点突变体的构建 | 第85-87页 |
| 2. 细胞培养和细胞瞬时转染 | 第87-90页 |
| ·细胞转染用质粒的提取 | 第87-88页 |
| ·细胞培养、传代、冻存及复苏 | 第88-89页 |
| ·细胞的瞬时转染 | 第89-90页 |
| 3. 转录活性分析 | 第90-91页 |
| 4. 雄性激素5α-DHT处理瞬时转染后细胞 | 第91页 |
| 四、结果 | 第91-96页 |
| 1. AR蛋白转录激活活性检测 | 第91-92页 |
| 2. 激素诱导黄鳝AR蛋白部分转运入核 | 第92-93页 |
| 3. 黄鳝AR蛋白核定位信号的进化分析 | 第93-94页 |
| 4. AR蛋白的核定位信号定位于DBD和Hinge结构域 | 第94-95页 |
| 5. AR蛋白的核定位信号关键氨基酸的确定 | 第95-96页 |
| 五、讨论 | 第96-98页 |
| 第四章:黄鳝AR蛋白的核输出信号 | 第98-111页 |
| 一、简介 | 第98-99页 |
| 二、材料 | 第99页 |
| 1. 质粒、菌种 | 第99页 |
| 2. 细胞系 | 第99页 |
| 3. 主要试剂和试剂盒 | 第99页 |
| 三、方法 | 第99-105页 |
| 1. 荧光表达载体的构建 | 第99-103页 |
| ·AR缺失突变体和定点突变体的引物设计 | 第99-101页 |
| ·融合荧光蛋白表达载体的构建 | 第101-103页 |
| 2. 细胞培养和细胞瞬时转染 | 第103-104页 |
| 3. 雄性激素5α-DHT处理瞬时转染后细胞 | 第104页 |
| 4. 核输出抑制剂LMB处理瞬时转染后细胞 | 第104-105页 |
| 四、结果 | 第105-109页 |
| 1. 激素处理后撤销导致核内AR蛋白转运出核 | 第105页 |
| 2. AR蛋白的核输出信号定位于LBD结构域 | 第105-107页 |
| 3. NES序列中的亮氨酸并不是AR核输出的关键氨基酸 | 第107-108页 |
| 4. AR蛋白的核输出不依赖于CRM-1 | 第108-109页 |
| 五、讨论 | 第109-111页 |
| 第五章:黄鳝AR蛋白入核的雄激素调控 | 第111-123页 |
| 一、简介 | 第111-112页 |
| 二、材料 | 第112页 |
| 1. 质粒、菌种 | 第112页 |
| 2. 细胞系 | 第112页 |
| 3. 主要试剂和试剂盒 | 第112页 |
| 三、方法 | 第112-115页 |
| 1. 荧光表达载体的构建 | 第112-114页 |
| ·AR野生型表达载体、缺失突变体和定点突变体的引物设计 | 第112-113页 |
| ·融合荧光蛋白表达载体的构建 | 第113-114页 |
| 2. 细胞培养和细胞瞬时转染 | 第114页 |
| 3. 雄性激素5α-DHT处理瞬时转染后细胞 | 第114-115页 |
| 4. 转录活性分析 | 第115页 |
| 5. 三维结构预测 | 第115页 |
| 四、结果 | 第115-121页 |
| 1. AR蛋白LBD结构域三维结构预测 | 第115-117页 |
| 2. 黄鳝AR与DHT的结合效率较哺乳类AR低 | 第117-118页 |
| 3. AR蛋白的LBD结构域配体结合区 | 第118-120页 |
| 4. AR蛋白与激素结合的关键氨基酸确定 | 第120-121页 |
| 五、讨论 | 第121-123页 |
| 研究总结 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-133页 |
| 研究生期间发表论文 | 第133-134页 |
| 致谢 | 第134页 |
