| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词 | 第10-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 环糊精概述 | 第15-16页 |
| 1.1.1 环糊精的结构 | 第15页 |
| 1.1.2 环糊精的应用 | 第15-16页 |
| 1.1.3 环糊精的生产 | 第16页 |
| 1.2 CGT 酶概述 | 第16-18页 |
| 1.2.1 CGT 酶的来源 | 第16页 |
| 1.2.2 CGT 酶的结构 | 第16-17页 |
| 1.2.3 CGT 酶的功能与应用 | 第17-18页 |
| 1.2.4 CGT 酶的催化机理 | 第18页 |
| 1.3 CGT 酶在基因工程菌中表达的研究现状 | 第18-19页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌重组蛋白表达系统 | 第19-21页 |
| 1.4.1 枯草杆菌表达系统载体 | 第20页 |
| 1.4.2 枯草杆菌表达系统蛋白质分泌机制 | 第20-21页 |
| 1.4.3 枯草杆菌表达系统的应用 | 第21页 |
| 1.5 CGT 酶热稳定性的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.6 酶热稳定性的提高策略 | 第22-24页 |
| 1.6.1 物理法 | 第22-23页 |
| 1.6.2 化学法 | 第23页 |
| 1.6.3 生物法 | 第23-24页 |
| 1.7 立题背景与意义 | 第24-25页 |
| 1.8 本论文的主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 β-CGT 酶在枯草杆菌中的分泌表达 | 第27-42页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-28页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第28页 |
| 2.2.4 培养基 | 第28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-30页 |
| 2.3.1 DNA 操作 | 第28-29页 |
| 2.3.2 β-CGT 酶基因的克隆 | 第29页 |
| 2.3.3 BamHⅠ位点的突变 | 第29页 |
| 2.3.4 表达载体 cgt/pST 的构建、转化 | 第29页 |
| 2.3.5 重组β-CGT 酶的生产 | 第29-30页 |
| 2.3.6 β-环化活力的测定 | 第30页 |
| 2.3.7 菌体浓度的测定 | 第30页 |
| 2.3.8 SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第30页 |
| 2.3.9 蛋白质浓度的测定 | 第30页 |
| 2.3.10 数据处理 | 第30页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第30-40页 |
| 2.4.1 表达载体 cgt/pST 的构建与转化 | 第30-32页 |
| 2.4.2 重组β-CGT 酶的摇瓶发酵优化 | 第32-40页 |
| 2.5 本章小结 | 第40-42页 |
| 第三章 重组β-CGT 酶的分离纯化及其生化性质分析 | 第42-53页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验材料 | 第42-43页 |
| 3.2.1 菌株和试剂 | 第42页 |
| 3.2.2 培养基 | 第42页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第42-43页 |
| 3.3 实验方法 | 第43-45页 |
| 3.3.1 重组β-CGT 酶的生产 | 第43页 |
| 3.3.2 重组β-CGT 酶的纯化 | 第43页 |
| 3.3.3 β-环化活力的测定 | 第43页 |
| 3.3.4 SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第43页 |
| 3.3.5 蛋白质浓度的测定 | 第43页 |
| 3.3.6 β-CGT 酶分子量的测定 | 第43-44页 |
| 3.3.7 β-CGT 酶最适温度和热稳定性的测定 | 第44页 |
| 3.3.8 β-CGT 酶最适 pH 和 pH 稳定性的测定 | 第44页 |
| 3.3.9 β-CGT 酶产物特异性分析 | 第44页 |
| 3.3.10 β-CGT 酶动力学参数的测定 | 第44-45页 |
| 3.3.11 金属离子对β-环化活力的影响 | 第45页 |
| 3.3.12 数据处理 | 第45页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第45-52页 |
| 3.4.1 酶的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3.4.2 酶分子量的测定 | 第46-47页 |
| 3.4.3 酶浓度对其热稳定性的影响 | 第47页 |
| 3.4.4 最适温度和热稳定性 | 第47-48页 |
| 3.4.5 最适 pH 和 pH 稳定性 | 第48-49页 |
| 3.4.6 产物特异性 | 第49-50页 |
| 3.4.7 动力学分析 | 第50-51页 |
| 3.4.8 金属离子对β-CGT 酶环化活力的影响 | 第51-52页 |
| 3.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 钙离子对β-CGT 酶热稳定性的影响 | 第53-64页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 实验材料 | 第53-54页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第53-54页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-55页 |
| 4.3.1 DNA 操作和序列比对 | 第54页 |
| 4.3.2 突变体的构建与转化 | 第54页 |
| 4.3.3 CGT 酶的生产与纯化 | 第54页 |
| 4.3.4 蛋白质浓度的测定 | 第54页 |
| 4.3.5 酶活分析 | 第54-55页 |
| 4.3.6 CGT 酶热稳定性的测定 | 第55页 |
| 4.3.7 CGT 酶空间结构模拟 | 第55页 |
| 4.3.8 微量差示扫描量热分析(Nano DSC) | 第55页 |
| 4.3.9 数据处理 | 第55页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第55-63页 |
| 4.4.1 钙离子对不同来源 CGT 酶环化活力的影响 | 第55-56页 |
| 4.4.2 钙离子对不同来源 CGT 酶热稳定性的影响 | 第56-57页 |
| 4.4.3 机理分析 | 第57-60页 |
| 4.4.4 钙离子对β-CGT 酶热失活过程的影响 | 第60-63页 |
| 4.5 本章小结 | 第63-64页 |
| 第五章 CaⅢ结合位点 Asp577 突变提高β-CGT 酶的热稳定性 | 第64-71页 |
| 5.1 引言 | 第64页 |
| 5.2 实验材料 | 第64页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第64页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第64页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第64页 |
| 5.3 实验方法 | 第64-66页 |
| 5.3.1 DNA 操作 | 第64-65页 |
| 5.3.2 Asp577 饱和突变体的构建与转化 | 第65-66页 |
| 5.3.3 β-CGT 酶及其突变体的生产与纯化 | 第66页 |
| 5.3.4 蛋白质浓度的测定 | 第66页 |
| 5.3.5 酶活分析 | 第66页 |
| 5.3.6 酶催化效率分析 | 第66页 |
| 5.3.7 热稳定性的测定 | 第66页 |
| 5.3.8 数据处理 | 第66页 |
| 5.3.9 β-CGT 酶空间结构显示 | 第66页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第66-69页 |
| 5.4.1 Asp577 饱和突变体的构建 | 第66页 |
| 5.4.2 Asp577 饱和突变对β-CGT 酶热稳定性的影响 | 第66-68页 |
| 5.4.3 机理分析 | 第68-69页 |
| 5.5 本章小结 | 第69-71页 |
| 第六章 纳米硅溶胶协同聚乙二醇提高β-CGT 酶的热稳定性 | 第71-83页 |
| 6.1 引言 | 第71页 |
| 6.2 实验材料 | 第71-72页 |
| 6.2.1 材料与试剂 | 第71页 |
| 6.2.2 主要仪器 | 第71-72页 |
| 6.3 实验方法 | 第72-73页 |
| 6.3.1 蛋白质浓度的测定 | 第72页 |
| 6.3.2 酶活分析 | 第72页 |
| 6.3.3 热稳定性的测定 | 第72页 |
| 6.3.4 表面疏水性的测定 | 第72页 |
| 6.3.5 原子力显微镜的测定 | 第72页 |
| 6.3.6 内源荧光的测定 | 第72页 |
| 6.3.7 远紫外圆二色谱的测定 | 第72-73页 |
| 6.3.8 数据处理 | 第73页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第73-82页 |
| 6.4.1 不同分子量 PEG 对β-CGT 酶环化活力的影响 | 第73页 |
| 6.4.2 不同分子量 PEG 对β-CGT 酶热稳定性的影响 | 第73-75页 |
| 6.4.3 纳米硅溶胶协同 PEG 1000 进一步提高β-CGT 酶的热稳定性 | 第75-76页 |
| 6.4.4 机理分析 | 第76-82页 |
| 6.5 本章小结 | 第82-83页 |
| 主要结论与展望 | 第83-86页 |
| 主要结论 | 第83-85页 |
| 展望 | 第85-86页 |
| 论文主要创新点 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-100页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第100-101页 |
