| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 英文缩略词表 | 第15-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-49页 |
| 第一章 GDF8基因的研究进展 | 第17-23页 |
| 1 GDF8基因的研究历史 | 第17页 |
| 2 GDF8基因的定位、结构及表达 | 第17-18页 |
| 3 GDF8功能的分子机制 | 第18-23页 |
| 3.1 MSTN与其受体的相互作用及信号传导 | 第19-20页 |
| 3.2 MSTN与Smad蛋白 | 第20-21页 |
| 3.3 MAPKs与MSTN信号的传导 | 第21页 |
| 3.4 Akt与FOXO转录因子在MSTN肌肉生长抑制中的作用 | 第21-23页 |
| 第二章 基因编辑技术概述 | 第23-39页 |
| 1 ZFN | 第23-27页 |
| 1.1 ZFN的发展历史 | 第23-24页 |
| 1.2 ZF的结构 | 第24-25页 |
| 1.3 ZFN在基因编辑中的应用 | 第25-27页 |
| 2 TALEN | 第27-31页 |
| 2.1 TALEN的发展历程 | 第27-28页 |
| 2.2 TALE的特异性DNA识别 | 第28-30页 |
| 2.3 TALEN在基因编辑中的应用 | 第30-31页 |
| 3 CRISPR/Cas9系统 | 第31-39页 |
| 3.1 CRISPR/Cas的研究历史 | 第31-32页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统的结构 | 第32-34页 |
| 3.3 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用 | 第34-37页 |
| 3.4 CRISPR/Cas系统在人类疾病治疗中的应用 | 第37-39页 |
| 第三章 细胞DNA损伤修复 | 第39-49页 |
| 1 细胞DNA损伤种类及修复途径 | 第39-40页 |
| 2 DNA损伤修复途径——NHEJ | 第40-42页 |
| 3 DNA损伤修复途径——HR | 第42-44页 |
| 4 不同细胞类型的DNA损伤修复 | 第44-45页 |
| 5 DSBs修复与染色体结构 | 第45-49页 |
| 5.1 DSBs修复与ATM | 第45-47页 |
| 5.2 DSBs修复与组蛋白乙酰化 | 第47-48页 |
| 5.3 染色体重塑复合物及相关因子与DSB修复 | 第48-49页 |
| 第二部分 实验研究 | 第49-111页 |
| 第一章 CRISPR/Cas9系统介导的鼠与兔的GDF8基因编辑 | 第49-73页 |
| 摘要 | 第49-50页 |
| 前言 | 第50页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-55页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9系统相关载体的构建 | 第51页 |
| 2.2 gRNA靶序列的设计及有效gRNA的筛选 | 第51-52页 |
| 2.3 Cas9 mRNA及sgRNA的获得 | 第52-53页 |
| 2.4 CRISPR/Cas9介导的GDF8基因编辑小鼠的生产 | 第53页 |
| 2.5 电穿孔介导的DNA转染兔的成纤维细胞 | 第53页 |
| 2.6 兔的超速排卵及胚胎收集 | 第53-54页 |
| 2.7 兔受精卵的hSpCas9 mRNA/sgRNA的胞质注射及其介导的胚胎的GDF8编辑 | 第54页 |
| 2.8 兔显微注射胚胎的移植 | 第54页 |
| 2.9 CRISPR/Cas9介导的仔兔基因突变的检测及脱靶检测 | 第54-55页 |
| 3 实验结果 | 第55-70页 |
| 3.1 载体构建 | 第55-56页 |
| 3.2 靶序列设计及有效gRNA的筛选 | 第56-58页 |
| 3.3 GDF8基因修饰小鼠的生产及鉴定 | 第58-60页 |
| 3.4 CRISPR/Cas9介导的兔成纤维细胞GDF8基因的编辑 | 第60-62页 |
| 3.5 CRISPR/Cas9介导的兔胚胎GDF8基因的编辑 | 第62-66页 |
| 3.6 GDF8基因编辑兔的生产及鉴定 | 第66-69页 |
| 3.7 GDF8基因编辑兔的脱靶检测 | 第69-70页 |
| 4 分析和讨论 | 第70-72页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9系统的建立 | 第70-71页 |
| 4.2 GDF8基因编辑兔的生产 | 第71-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9介导的水牛和猪的GDF8基因的敲除 | 第73-94页 |
| 摘要 | 第73页 |
| 前言 | 第73-74页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第74页 |
| 2 实验方法 | 第74-78页 |
| 2.1 gRNA靶序列的设计及筛选 | 第74-75页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9系统介导的水牛和德保猪成纤维细胞的GDF8基因的修饰 | 第75页 |
| 2.3 IVF-CI和ICSI-CI | 第75-76页 |
| 2.5 CRISPR/Cas9系统介导的水牛和猪胚胎的GDF8基因编辑 | 第76页 |
| 2.6 水牛和猪GDF8基因修饰胚胎的移植 | 第76页 |
| 2.7 初生牛犊的GDF8基因突变检测 | 第76-77页 |
| 2.8 水牛beta-actin基因gRNA载体及同源重组载体的构建 | 第77-78页 |
| 2.9 CRISPR/Cas9介导的水牛、德保猪成纤维细胞外源DNA的定点整合 | 第78页 |
| 3 实验结果 | 第78-90页 |
| 3.1 载体构建 | 第78页 |
| 3.2 有效gRNA的筛选 | 第78-79页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9系统介导的德保猪和水牛成纤维细胞GDF8基因的编辑 | 第79-83页 |
| 3.4 CRISRP/Cas9介导的猪和水牛胚胎内源基因GDF8的编辑 | 第83-86页 |
| 3.5 初生牛犊GDF8基因突变检测 | 第86-87页 |
| 3.6 CRISPR/Cas9系统介导的水牛和德保猪成纤维细胞外源基因的定点整合 | 第87-90页 |
| 4 分析与讨论 | 第90-92页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9系统介导的德保猪成纤维细胞的GDF8基因编辑 | 第90页 |
| 4.2 CRISPR/Cas9系统介导的猪胚胎的GDF8基因编辑 | 第90-91页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统介导的水牛成纤维细胞的GDF8基因编辑 | 第91页 |
| 4.4 CRISPR/Cas9系统介导的水牛胚胎的GDF8基因编辑 | 第91-92页 |
| 4.5 CRISPR/Cas9介导的德保猪和水牛成纤维细胞外源基因的定点整合 | 第92页 |
| 5 结论 | 第92-94页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统在哺乳动物应用中的优化 | 第94-111页 |
| 摘要 | 第94页 |
| 前言 | 第94-95页 |
| 1 实验材料及仪器设备 | 第95页 |
| 2 实验方法 | 第95-100页 |
| 2.1 相关载体的构建 | 第95-97页 |
| 2.2 RGS-CR HEK 293T细胞系的筛选 | 第97页 |
| 2.3 有效gRNA的筛选 | 第97页 |
| 2.4 不同转录终止信号Cas9表达载体对基因编辑效率的影响 | 第97-98页 |
| 2.5 VPA对CRISPR/Cas9介导的内源基因DSBs的影响 | 第98页 |
| 2.6 VPA对CRISPR/Cas9介导的HR效率的影响 | 第98-99页 |
| 2.7 VPA对DSBs修复相关因子表达的影响 | 第99页 |
| 2.8 DNA修复途径HR相关因子Rad51对CRISPR/Cas9介导的HR的影响 | 第99-100页 |
| 3 实验结果 | 第100-108页 |
| 3.1 人Rad51真核表达载体及2A-EGFP无启动子同源重组报告载体的构建 | 第100-101页 |
| 3.2 RGS-CR细胞系的建立 | 第101页 |
| 3.3 不同转录终止信号hSpCas9表达载体对基因编辑效率的影响 | 第101-102页 |
| 3.4 VPA对CRISPR/Cas9介导的NHEJ的影响 | 第102-103页 |
| 3.5 不同浓度VPA对NHEJ相关修复因子表达的影响 | 第103-104页 |
| 3.6 有效gRNA的筛选及VPA对CRISPR/Cas9介导的HR的影响 | 第104-106页 |
| 3.7 VPA对DSBs修复相关因子表达的影响 | 第106-107页 |
| 3.8 过表达DNA损伤修复途径相关因子对HR效率的影响 | 第107-108页 |
| 4 分析讨论 | 第108-110页 |
| 4.1 不同hSpCas9真核表达载体对基因编辑效率的影响 | 第108页 |
| 4.2 VPA对CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑效率的影响 | 第108-110页 |
| 5 结论 | 第110-111页 |
| 论文总结论 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-134页 |
| 附录 | 第134-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
| 攻读学位期间发表论文及专利 | 第138页 |
