| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 1 引言和文献综述 | 第11-25页 |
| 1.1 模式生物斑马鱼概述 | 第11-14页 |
| 1.1.1 斑马鱼研究进展简述 | 第11-12页 |
| 1.1.2 斑马鱼胚胎发育过程简述 | 第12-13页 |
| 1.1.3 斑马鱼心脏发育过程简述 | 第13-14页 |
| 1.2 转基因斑马鱼技术 | 第14-21页 |
| 1.2.1 转基因斑马鱼研究进展简述 | 第15-16页 |
| 1.2.2 Tol2转座子系统 | 第16-19页 |
| 1.2.3 CRE/loxP重组酶系统 | 第19-21页 |
| 1.3 CRISPR/CAS9基因打靶技术 | 第21-23页 |
| 1.4 本文研究的意义 | 第23-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-43页 |
| 2.1 材料 | 第25-29页 |
| 2.1.1 主要试剂、抗体和试剂盒 | 第25-26页 |
| 2.1.2 主要溶液 | 第26-28页 |
| 2.1.3 主要实验仪器和耗材 | 第28-29页 |
| 2.2 方法 | 第29-43页 |
| 2.2.1 地高辛标记的RNA探针的合成 | 第29-31页 |
| 2.2.2 斑马鱼整体胚胎原位杂交 | 第31-34页 |
| 2.2.3 高保真PCR扩增目的片段 | 第34-35页 |
| 2.2.4 载体的连接及转化 | 第35页 |
| 2.2.5 质粒的小量提取与鉴定 | 第35-37页 |
| 2.2.6 酶切产物的纯化回收 | 第37-38页 |
| 2.2.7 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.2.8 mRNA的转录合成 | 第38-39页 |
| 2.2.9 mRNA的纯化(RNeasy Mini试剂盒法) | 第39页 |
| 2.2.10 基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.2.11 蛋白的提取 | 第40页 |
| 2.2.12 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第40-41页 |
| 2.2.13 Western-blot免疫印迹分析 | 第41页 |
| 2.2.14 斑马鱼的饲养及显微注射 | 第41-43页 |
| 3 实验结果及其分析 | 第43-64页 |
| 3.1 利用整体胚胎原位杂交分析HPRG1的表达 | 第43-44页 |
| 3.1.1 HPRG1探针合成的结果 | 第43页 |
| 3.1.2 HPRG1探针的原位杂交结果 | 第43-44页 |
| 3.2 转基因斑马鱼品系的构建 | 第44-59页 |
| 3.2.1 Tol2转座酶mRNA的制备 | 第44-45页 |
| 3.2.2 pTol2(CMLC2:HPRG1-EGFP)过表达品系的建立 | 第45-49页 |
| 3.2.3 pTol2(HPRG1(1kb):EGFP)品系的构建及鉴定 | 第49-51页 |
| 3.2.4 pTol2(HPRG1(2kb):EGFP)品系的构建及鉴定 | 第51-52页 |
| 3.2.5 pTol2(HPRG1(3kb)：EGFP)品系的建立 | 第52-54页 |
| 3.2.6 pTol2(CMLC2：CRE-IRES-EGFP)品系的建立 | 第54-59页 |
| 3.3 CRISPR/CAS9打靶技术敲除斑马鱼HPRG1基因 | 第59-61页 |
| 3.3.1 CRISPR表达质粒的构建 | 第59-60页 |
| 3.3.2 CRISPR表达质粒的体内活性检测 | 第60-61页 |
| 3.4 验证HPRG1-morpholino的有效性 | 第61-64页 |
| 3.4.1 pCMV-HPRG1-EGFP-N2质粒的构建及鉴定 | 第61-62页 |
| 3.4.2 HPRG1-morpholino的体内活性验证 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-67页 |
| 5 结语 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 附录1 | 第74-75页 |
| 附录2 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
