| 摘要 | 第18-20页 |
| Abstract | 第20-21页 |
| 符号说明及缩略词 | 第22-25页 |
| 第一章 文献综述 | 第25-50页 |
| 1.1 放线菌概述 | 第25-26页 |
| 1.2 安莎类抗生素简介 | 第26-30页 |
| 1.2.1 安莎类抗生素的分类 | 第27页 |
| 1.2.2 安莎类抗生素的生理活性 | 第27-28页 |
| 1.2.3 安莎类抗生素的生物合成 | 第28-30页 |
| 1.3 抗生素生物合成的调控 | 第30-33页 |
| 1.3.1 抗生素生物合成的途径专一性调控 | 第31-32页 |
| 1.3.2 抗生素生物合成的全局性调控 | 第32-33页 |
| 1.4 LuxR概述 | 第33-35页 |
| 1.5 天然产物中生物活性物质的挖掘 | 第35-36页 |
| 1.6 宏基因组技术和宏基因组文库 | 第36-39页 |
| 1.7 BAC文库和基因簇异源表达 | 第39-44页 |
| 1.7.1 BAC文库概述 | 第39-42页 |
| 1.7.1.1 BAC载体 | 第39-41页 |
| 1.7.1.2 HMW DNA的提取 | 第41-42页 |
| 1.7.2 生物合成基因簇的异源表达 | 第42-44页 |
| 1.8 Red/ET重组及其在基因簇拼接中的应用 | 第44-49页 |
| 1.8.1 Red/ET重组 | 第44-49页 |
| 1.9 IK细胞因子的进化生物学分析 | 第49-50页 |
| 第二章 pCCESAC系列载体的构建和功能验证 | 第50-76页 |
| 2.1 实验材料 | 第50-54页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第50-51页 |
| 2.1.2 培养基 | 第51页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第51-53页 |
| 2.1.3.1 常用溶液配制 | 第51-53页 |
| 2.1.3.2 常用试剂盒和其他生化试剂 | 第53页 |
| 2.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第53-54页 |
| 2.2 实验方法 | 第54-67页 |
| 2.2.1 载体构建中所使用的引物信息 | 第54-56页 |
| 2.2.2 pCCBAC的构建 | 第56-60页 |
| 2.2.2.1 pCClFOS质粒的转化和提取 | 第56-58页 |
| 2.2.2.2 pCCBAC的获得 | 第58-60页 |
| 2.2.3 pCCESAC1的构建 | 第60-62页 |
| 2.2.4 pCCESAC2的构建 | 第62-63页 |
| 2.2.5 pCCESAC3的构建 | 第63-64页 |
| 2.2.6 pCCESAC41的构建 | 第64页 |
| 2.2.7 pCCESAC82的构建 | 第64-65页 |
| 2.2.8 pCCESAC23的构建 | 第65-66页 |
| 2.2.9 pCCESAC系列载体的功能验证 | 第66-67页 |
| 2.2.9.1 sacB基因的功能验证 | 第66页 |
| 2.2.9.2 ermE启动子的功能验证 | 第66-67页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第67-75页 |
| 2.3.1 载体构建 | 第67-74页 |
| 2.3.2 载体的功能验证 | 第74-75页 |
| 2.4 本章小结 | 第75-76页 |
| 第三章 基于pCCESAC82构建E.coli-Actinosynnema pretiosum31565穿梭BAC文库的方法探究 | 第76-109页 |
| 3.1 实验材料 | 第76-81页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第76-77页 |
| 3.1.2 培养基 | 第77页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第77-81页 |
| 3.1.3.1 常用溶液配制 | 第77-80页 |
| 3.1.3.2 常用试剂盒和其他生化试剂 | 第80-81页 |
| 3.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第81页 |
| 3.2 实验方法 | 第81-96页 |
| 3.2.1 本章使用的引物信息 | 第81页 |
| 3.2.2 基因组DNA的提取方法 | 第81-84页 |
| 3.2.2.1 原生质体包埋法提取基因组DNA | 第81-83页 |
| 3.2.2.2 STE裂解法提取基因组DNA | 第83-84页 |
| 3.2.2.3 溶菌酶酶解法提取基因组DNA | 第84页 |
| 3.2.2.4 溶菌酶-TE9裂解法提取基因组DNA | 第84页 |
| 3.2.3 DNA plug的部分酶切 | 第84-85页 |
| 3.2.4 大片段DNA的获得 | 第85-88页 |
| 3.2.4.1 DNA plug的脉冲场电泳 | 第86页 |
| 3.2.4.2 普通低熔点凝胶电泳 | 第86-87页 |
| 3.2.4.3 电洗脱 | 第87-88页 |
| 3.2.4.4 DNA透析除盐 | 第88页 |
| 3.2.5 DNA的末端补平 | 第88页 |
| 3.2.6 平末端DNA连接BstXI adaptor | 第88-89页 |
| 3.2.7 BstXI粘端DNA的回收 | 第89页 |
| 3.2.8 BstXI粘端DNA与载体连接 | 第89-91页 |
| 3.2.9 tRNA沉淀连接产物 | 第91页 |
| 3.2.10 电转化连接产物 | 第91页 |
| 3.2.11 文库质粒提取 | 第91-92页 |
| 3.2.12 提高感受态转化效率的优化方案 | 第92-93页 |
| 3.2.12.1 普通方法制备感受态 | 第92页 |
| 3.2.12.2 扩大培养体积制备感受态 | 第92页 |
| 3.2.12.3 全新方法制备感受态 | 第92-93页 |
| 3.2.12.4 乙醇添加入转化体系的尝试 | 第93页 |
| 3.2.12.5 tRNA助沉DNA的条件摸索 | 第93页 |
| 3.2.13 基于T4 DNA ligase的提高感受态转化效率的方案 | 第93-96页 |
| 3.2.13.1 T4 DNA ligase的表达载体构建 | 第93页 |
| 3.2.13.2 T4 DNA ligase在大肠杆菌中表达条件的摸索 | 第93-95页 |
| 3.2.13.3 T4 DNA ligase在大肠杆菌中的梯度表达实验 | 第95页 |
| 3.2.13.4 大肠杆菌BL21不同生长温度下的生长曲线测定 | 第95-96页 |
| 3.2.13.5 大肠杆菌BL21在合适生长条件下的蛋白表达和转化效率测定 | 第96页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第96-106页 |
| 3.3.1 原生质体制备条件 | 第96-97页 |
| 3.3.2 基因组DNA的提取方法和提取结果 | 第97-100页 |
| 3.3.3 基于T4 DNA ligase表达方案的实验结果 | 第100-103页 |
| 3.3.4 制备高效感受态的方法 | 第103-104页 |
| 3.3.5 基于BstXI adaptor的连接方法 | 第104-105页 |
| 3.3.6 BAC文库的构建情况 | 第105-106页 |
| 3.4 本章小结 | 第106-109页 |
| 第四章 安莎霉素生物合成基因簇的拼接 | 第109-125页 |
| 4.1 实验材料 | 第109-111页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第109-110页 |
| 4.1.2 培养基 | 第110页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第110页 |
| 4.1.3.1 常用溶液配制 | 第110页 |
| 4.1.3.2 常用试剂盒和其他生化试剂 | 第110页 |
| 4.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第110-111页 |
| 4.2 实验方法 | 第111-116页 |
| 4.2.1 本章使用的引物信息 | 第111页 |
| 4.2.2 tam基因簇的拼接 | 第111-113页 |
| 4.2.2.1 pCCESAC2-M1464的获得-第一轮拼接 | 第111-113页 |
| 4.2.2.2 pCCESAC2-tam的获得-第二轮拼接 | 第113页 |
| 4.2.3 nas基因簇的拼接 | 第113-116页 |
| 4.2.3.1 包含nas基因簇的fosmid克隆的文库筛选 | 第113-115页 |
| 4.2.3.2 pCCESAC2-5H11的获得-第一轮拼接 | 第115页 |
| 4.2.3.3 pCCESAC2-5H11-4H5的获得-第二轮拼接 | 第115页 |
| 4.2.3.4 pCCESAC2-nas的获得-第三轮拼接 | 第115-116页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第116-124页 |
| 4.3.1 tam基因簇的拼接 | 第116-119页 |
| 4.3.2 nas基因簇的拼接 | 第119-124页 |
| 4.4 本章小结 | 第124-125页 |
| 第五章 安莎霉素基因簇的调控和异源表达 | 第125-151页 |
| 5.1 实验材料 | 第125-128页 |
| 5.1.1 菌株和质粒 | 第125-126页 |
| 5.1.2 培养基 | 第126-127页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第127-128页 |
| 5.1.3.1 常用溶液配制 | 第127-128页 |
| 5.1.3.2 常用试剂盒和其他生化试剂 | 第128页 |
| 5.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第128页 |
| 5.2 实验方法 | 第128-143页 |
| 5.2.1 本章使用的引物信息 | 第128-130页 |
| 5.2.2 tam基因簇的表达调控 | 第130-133页 |
| 5.2.2.1 PermE~*强启动子元件的构建 | 第130-132页 |
| 5.2.2.2 tam基因簇启动子置换 | 第132-133页 |
| 5.2.3 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12中的异源表达和检测 | 第133-140页 |
| 5.2.3.1 tam基因簇转入Streptomyces coelicolor ZM12 | 第133页 |
| 5.2.3.2 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12的PCR检测 | 第133页 |
| 5.2.3.3 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12中的southern blot检测 | 第133-137页 |
| 5.2.3.4 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12中的RT-PCR检测 | 第137-139页 |
| 5.2.3.5 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12的表达产物检测 | 第139-140页 |
| 5.2.4 tam基因簇在Amycolatopsis mediterranei s699中的异源表达和检测 | 第140-143页 |
| 5.2.4.1 文库筛选 | 第140页 |
| 5.2.4.2 rifA基因部分区段的敲除 | 第140-142页 |
| 5.2.4.3 Amycolatopsis mediterranei s699ΔrifA的产物检测 | 第142页 |
| 5.2.4.4 tam基因簇转入Amycolatopsis mediterranei s699ΔrifA | 第142-143页 |
| 5.2.5 tam基因簇在Thermophilic Streptomyces sp.4F中的异源表达 | 第143页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第143-149页 |
| 5.3.1 tam基因簇的启动子置换 | 第143-145页 |
| 5.3.2 tam基因簇在Streptomyces coelicolor ZM12的异源表达和检测 | 第145-147页 |
| 5.3.3 tam基因簇在Amycolatopsis mediterranei s699ΔrifA中的异源表达和检测 | 第147-148页 |
| 5.3.4 tam基因簇在Thermophilic Streptomyces sp.4F中的异源表达和检测 | 第148-149页 |
| 5.3.5 nas基因簇的异源表达 | 第149页 |
| 5.5 本章小结 | 第149-151页 |
| 第六章 双选择性抗生素存在条件下大肠杆菌间质粒接合转移机制研究 | 第151-204页 |
| 6.1 实验材料 | 第151-157页 |
| 6.1.1 菌株和质粒 | 第151-152页 |
| 6.1.2 培养基 | 第152页 |
| 6.1.3 实验试剂 | 第152-156页 |
| 6.1.3.1 常用溶液配制 | 第152-156页 |
| 6.1.3.2 常用试剂盒和其他生化试剂 | 第156页 |
| 6.1.4 主要仪器设备和耗材 | 第156页 |
| 6.1.5 分析软件及网站 | 第156-157页 |
| 6.2 实验方法 | 第157-171页 |
| 6.2.1 本章使用的引物信息 | 第157页 |
| 6.2.2 大肠杆菌菌体培养 | 第157-158页 |
| 6.2.3 接合质粒验证及转化 | 第158-159页 |
| 6.2.3.1 接合质粒验证 | 第158页 |
| 6.2.3.2 接合质粒转化 | 第158-159页 |
| 6.2.4 抗性菌株MIC值测定 | 第159-160页 |
| 6.2.5 大肠杆菌菌株间的接合转移 | 第160-161页 |
| 6.2.5.1 大肠杆菌液体接合转移方法 | 第160-161页 |
| 6.2.5.2 供受体菌单一抗生素处理的接合转移方法 | 第161页 |
| 6.2.6 接合供受体蛋白提取 | 第161页 |
| 6.2.7 蛋白纯化 | 第161-163页 |
| 6.2.8 蛋白浓度测定 | 第163页 |
| 6.2.9 双向电泳操作方法 | 第163-166页 |
| 6.2.10 染色 | 第166-167页 |
| 6.2.11 考染蛋白胶内酶解 | 第167页 |
| 6.2.12 蛋白质谱鉴定 | 第167-168页 |
| 6.2.13 实时荧光定量PCR | 第168-170页 |
| 6.2.14 大肠杆菌接合差异蛋白编码基因敲除 | 第170-171页 |
| 6.3 实验结果与讨论 | 第171-202页 |
| 6.3.1 质粒pRK2013、RP4、pSU2007转化及验证结果 | 第171-173页 |
| 6.3.2 接合菌株MIC值测定结果 | 第173-175页 |
| 6.3.3 供受体菌株及其抗生素抗性 | 第175-176页 |
| 6.3.4 DH5α(pRK2013)/HB101接合转移 | 第176-179页 |
| 6.3.4.1 DH5α(pRK2013)/HB101接合转移曲线 | 第176-179页 |
| 6.3.5 液体接合转移(不同抗生素浓度及抗生素组合) | 第179-181页 |
| 6.3.6 DH5α(RP4)/HB101接合转移 | 第181-183页 |
| 6.3.7 DH5α(pSU2007)/HB101接合转移 | 第183-184页 |
| 6.3.8 DH5α(pRK2013)/HB101在无抗生素及双选择抗生素作用下,差异蛋白质组实验 | 第184-186页 |
| 6.3.9 双向电泳图谱分析结果 | 第186-187页 |
| 6.3.10 MALDI-TOF/TOF MS蛋白鉴定及肽指纹图谱分析 | 第187-196页 |
| 6.3.11 差异表达蛋白OppA和RbsB编码基因Real-Time PCR验证 | 第196-197页 |
| 6.3.12 差异表达蛋白编码基因oppA、rbsB敲除实验 | 第197-199页 |
| 6.3.13 差异表达蛋白OppA和RbsB编码基因受体敲除接合效率功能验证 | 第199-202页 |
| 6.4 本章小结 | 第202-204页 |
| 全文总结与展望 | 第204-206页 |
| 附录 | 第206-216页 |
| 致谢 | 第216-217页 |
| 参考文献 | 第217-225页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第225-243页 |
| 学位论文评阅及答辩情况 | 第243页 |
