| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-31页 |
| 1.1 结核病概述 | 第15页 |
| 1.2 结核病的流行情况 | 第15-16页 |
| 1.3 结核病病原学概况 | 第16-18页 |
| 1.3.1 结核分枝杆菌生物特性 | 第16-17页 |
| 1.3.2 结核分枝杆菌基因组特征 | 第17-18页 |
| 1.4 结核分枝杆菌的致病机制 | 第18-19页 |
| 1.4.1 分枝杆菌细胞壁结构 | 第18-19页 |
| 1.4.2 结核病的发生发展过程 | 第19页 |
| 1.5 脂肪酶 | 第19-30页 |
| 1.5.1 脂肪酶简介 | 第19-20页 |
| 1.5.2 脂肪酶的分类 | 第20-23页 |
| 1.5.3 脂肪酶的结构 | 第23-25页 |
| 1.5.4 脂肪酶的催化机制 | 第25-27页 |
| 1.5.5 分枝杆菌脂肪酶 | 第27-29页 |
| 1.5.6 脂肪酶在分枝杆菌中的作用 | 第29-30页 |
| 1.6 本研究的目的与意义 | 第30-31页 |
| 第二章 结核分枝杆菌脂肪酶功能基因在大肠杆菌中克隆表达 | 第31-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第31页 |
| 2.1.1 载体和菌株 | 第31页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第31页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.2.1 结核分枝杆菌基因组的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.2 引物的设计 | 第32-34页 |
| 2.2.3 结核分枝杆菌lip家族基因的扩增 | 第34页 |
| 2.2.4 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒的构建 | 第34-36页 |
| 2.2.5 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.6 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒的诱导表达 | 第37页 |
| 2.3 实验结果 | 第37-40页 |
| 2.3.1 结核分枝杆菌lip家族基因的扩增结果 | 第37-38页 |
| 2.3.2 重组质粒鉴定结果 | 第38-39页 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达情况 | 第39-40页 |
| 2.4 讨论 | 第40页 |
| 2.5 小结 | 第40-41页 |
| 第三章 用耻垢分枝杆菌表达系统筛选脂肪酶功能基因 | 第41-48页 |
| 3.1 实验材料 | 第41页 |
| 3.1.1 载体和菌株 | 第41页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第41页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 结核分枝杆菌lip家族基因连接pMV262穿梭载体构建重组质粒 | 第41-42页 |
| 3.2.2 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.3 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒电转化耻垢分枝杆菌感受态细胞 | 第43页 |
| 3.2.4 结核分枝杆菌lip家族基因在耻垢分枝杆菌中表达Western blot验证 | 第43-44页 |
| 3.2.5 脂肪酶活力的测定 | 第44页 |
| 3.3 实验结果 | 第44-46页 |
| 3.3.1 结核分枝杆菌lip家族基因重组质粒的鉴定结果 | 第44-45页 |
| 3.3.2 结核分枝杆菌lip家族基因在耻垢分枝杆菌中表达Western blot结果 | 第45-46页 |
| 3.3.3 脂肪酶活力的测定结果 | 第46页 |
| 3.4 讨论 | 第46-47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 结核分枝杆菌脂肪酶功能基因lipL的研究 | 第48-67页 |
| 4.1 实验材料 | 第48页 |
| 4.1.1 载体和菌株 | 第48页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第48页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-51页 |
| 4.2.1 构建乙酰胺可诱导型耻垢分枝杆菌表达载体pAIN | 第48-50页 |
| 4.2.2 结核分枝杆菌lipL基因的PCR扩增 | 第50页 |
| 4.2.3 重组质粒pAIN-lipL的构建及鉴定 | 第50页 |
| 4.2.4 重组质粒pAIN-lipL的电转化耻垢分枝杆菌感受态细胞 | 第50页 |
| 4.2.5 重组蛋白LipL在耻垢分枝杆菌中的诱导表达及诱导条件优化 | 第50-51页 |
| 4.2.6 在耻垢分枝杆菌中纯化Lip L蛋白 | 第51页 |
| 4.2.7 重组蛋白Lip L的Western blot验证 | 第51页 |
| 4.2.8 重组蛋白LipL的质谱验证 | 第51页 |
| 4.3 脂肪酶酶学性质初步表征 | 第51-52页 |
| 4.3.1 LipL蛋白脂肪酶活力及底物特异性的测定 | 第51页 |
| 4.3.2 LipL蛋白脂肪酶活力最适温度的测定 | 第51-52页 |
| 4.3.3 LipL蛋白脂肪酶活力最适pH的测定 | 第52页 |
| 4.3.4 去污剂对LipL蛋白脂肪酶活力的影响 | 第52页 |
| 4.4 脂肪酶活性中心的确定 | 第52-53页 |
| 4.4.1 引物的设计 | 第52页 |
| 4.4.2 构建点突变重组质粒 | 第52-53页 |
| 4.4.3 点突变重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达和纯化 | 第53页 |
| 4.4.4 点突变蛋白的脂肪酶活力测定 | 第53页 |
| 4.4.5 LipL蛋白 3D同源建模 | 第53页 |
| 4.5 实验结果 | 第53-65页 |
| 4.5.1 重组质粒pAIN-lipL的鉴定 | 第53-54页 |
| 4.5.2 在耻垢分枝杆菌中纯化Lip L蛋白和Western blot结果 | 第54-55页 |
| 4.5.3 LipL蛋白的质谱分析结果 | 第55-57页 |
| 4.5.4 LipL蛋白脂肪酶活性分析结果 | 第57-60页 |
| 4.5.5 脂肪酶活性中心确定结果 | 第60-65页 |
| 4.6 讨论 | 第65-66页 |
| 4.7 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 结核分枝杆菌Lip L蛋白的定位及抗原性分析 | 第67-77页 |
| 5.1 实验材料 | 第67页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第67页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第67页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第67页 |
| 5.2 实验方法 | 第67-70页 |
| 5.2.1 LipL蛋白亚细胞定位的生物信息学分析 | 第67页 |
| 5.2.2 差速离心法分离亚细胞组分 | 第67-68页 |
| 5.2.3 Western blot分析LipL蛋白在分枝杆菌中的亚细胞定位 | 第68页 |
| 5.2.4 ELISA检测LipL蛋白反应原性 | 第68-69页 |
| 5.2.5 LipL蛋白免疫BALB/c小鼠动物实验 | 第69页 |
| 5.2.6 LipL耻垢分枝杆菌重组菌在小鼠肺部定殖能力的分析 | 第69-70页 |
| 5.3 实验结果 | 第70-75页 |
| 5.3.1 LipL蛋白亚细胞定位的生物信息学分析结果 | 第70-71页 |
| 5.3.2 Western blot分析LipL蛋白在分枝杆菌中的亚细胞定位结果 | 第71页 |
| 5.3.3 ELISA检测LipL蛋白反应原性结果 | 第71-72页 |
| 5.3.4 LipL蛋白免疫小鼠抗体水平的检测结果 | 第72-73页 |
| 5.3.5 流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞结果 | 第73-74页 |
| 5.3.6 LipL耻垢分枝杆菌重组菌在小鼠肺部定殖能力分析 | 第74-75页 |
| 5.4 讨论 | 第75-76页 |
| 5.5 小结 | 第76-77页 |
| 第六章 全文结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 作者简历 | 第87页 |
