| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-28页 |
| 1.1 腈水解酶 | 第12-17页 |
| 1.1.1 腈水解酶来源 | 第12-13页 |
| 1.1.2 腈水解酶催化机理 | 第13-14页 |
| 1.1.3 腈水解酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.1.4 腈水解酶法制备氯吡格雷手性中间体(R)-2a | 第15-17页 |
| 1.2 基因改造 | 第17-21页 |
| 1.2.1 定向进化 | 第17-20页 |
| 1.2.1.1 DNA改组 | 第18-19页 |
| 1.2.1.2 易错PCR | 第19页 |
| 1.2.1.3 定点突变和饱和突变技术 | 第19-20页 |
| 1.2.2 理性设计 | 第20-21页 |
| 1.2.3 半理性设计 | 第21页 |
| 1.3 基因改造在腈水解酶中的应用 | 第21-25页 |
| 1.4 本论文的选题意义和研究内容 | 第25-28页 |
| 1.4.1 本论文的选题意义 | 第25-26页 |
| 1.4.2 本论文的研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 腈水解酶的分子改造 | 第28-42页 |
| 2.1 前言 | 第28-29页 |
| 2.2 材料与方法 | 第29-35页 |
| 2.2.1 材料 | 第29-30页 |
| 2.2.1.1 菌种与载体 | 第29页 |
| 2.2.1.2 培养基 | 第29页 |
| 2.2.1.3 工具酶及试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.1.4 主要实验仪器 | 第30页 |
| 2.2.2 试验方法 | 第30-35页 |
| 2.2.2.1 质粒提取 | 第30页 |
| 2.2.2.2 突变文库的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.2.3 Dpn I酶切 | 第31-32页 |
| 2.2.2.4 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第32页 |
| 2.2.2.5 酶切产物的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.2.6 突变体库的初筛 | 第33页 |
| 2.2.2.7 突变体库的复筛 | 第33-34页 |
| 2.2.2.8 HPLC检测方法 | 第34页 |
| 2.2.2.9 正突变子序列测定 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第35-41页 |
| 2.3.1 nitA序列比对 | 第35-36页 |
| 2.3.2 同源模型的建立和模型评价 | 第36-37页 |
| 2.3.3 对接结果和突变位点的选择 | 第37-39页 |
| 2.3.4 突变文库的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.5 高活力突变体筛选 | 第40-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 腈水解酶突变体酶学性质研究 | 第42-59页 |
| 3.1 前言 | 第42-43页 |
| 3.2 材料与方法 | 第43-47页 |
| 3.2.1 材料 | 第43-44页 |
| 3.2.1.1 菌种 | 第43页 |
| 3.2.1.2 培养基 | 第43页 |
| 3.2.1.3 主要试剂 | 第43页 |
| 3.2.1.4 主要仪器 | 第43-44页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第44-47页 |
| 3.2.2.1 菌体培养 | 第44页 |
| 3.2.2.2 细胞破碎 | 第44页 |
| 3.2.2.3 镍柱纯化 | 第44页 |
| 3.2.2.4 SDS-PAGE分析 | 第44-45页 |
| 3.2.2.5 BCA蛋白浓度测定 | 第45页 |
| 3.2.2.6 酶活测定 | 第45-46页 |
| 3.2.2.7 最适温度和热稳定性 | 第46页 |
| 3.2.2.8 最适pH和pH温度性 | 第46页 |
| 3.2.2.9 nitA和T132A/F189T催化各底物动力学常数的比较 | 第46页 |
| 3.2.2.11 同源建模及分子对接 | 第46-47页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第47-57页 |
| 3.3.1 纯酶的获得 | 第47页 |
| 3.3.2 活力测定 | 第47-48页 |
| 3.3.3 酶促反应动力学 | 第48-50页 |
| 3.3.4 温度对酶活力的影响 | 第50-52页 |
| 3.3.5 pH对酶活力的影响 | 第52-54页 |
| 3.3.6 突变体活力提高的机理分析 | 第54-57页 |
| 3.4 本章小结 | 第57-59页 |
| 第四章 腈水解酶突变体在(R)-2a合成中的应用 | 第59-72页 |
| 4.1 前言 | 第59页 |
| 4.2 材料与方法 | 第59-62页 |
| 4.2.1 菌种、培养基及主要仪器 | 第59-60页 |
| 4.2.2 静息细胞的制备 | 第60页 |
| 4.2.3 静息细胞的转化条件优化 | 第60-62页 |
| 4.2.3.1 温度对静息细胞催化的影响 | 第60页 |
| 4.2.3.2 pH对静息细胞催化的影响 | 第60页 |
| 4.2.3.3 底物浓度对静息细胞催化的影响 | 第60页 |
| 4.2.3.4 金属离子对静息细胞催化的影响 | 第60-61页 |
| 4.2.3.5 两相体系中突变体的水解反应 | 第61页 |
| 4.2.3.6 在两相体系中批次补料制备(R)-2a | 第61页 |
| 4.2.3.7 (R)-2a的克级制备 | 第61-62页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第62-71页 |
| 4.3.1 温度对静息细胞催化的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.2 pH对静息细胞催化的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.3 底物浓度对静息细胞催化的影响 | 第64页 |
| 4.3.4 金属离子对静息细胞催化的影响 | 第64-66页 |
| 4.3.5 两相体系中突变体的水解反应 | 第66-67页 |
| 4.3.6 在两相体系中批次补料制备(R)-2a | 第67-68页 |
| 4.3.7 (R)-2a的克级制备 | 第68-71页 |
| 4.4 本章小结 | 第71-72页 |
| 第五章 结论与展望 | 第72-75页 |
| 5.1 结论 | 第72-73页 |
| 5.2 展望 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 附录1 | 第81-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第85页 |
