| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| 1.1 手性药物概述 | 第11-13页 |
| 1.1.1 手性药物 | 第11页 |
| 1.1.2 手性醇在手性药物中应用与合成 | 第11-13页 |
| 1.1.2.1 手性醇在手性制药领域中应用 | 第11-12页 |
| 1.1.2.2 手性醇获得途径 | 第12-13页 |
| 1.2 生物法不对称催化合成手性醇 | 第13-16页 |
| 1.2.1 生物细胞催化不对称合成手性醇 | 第13-15页 |
| 1.2.2 酶法不对称合成手性醇及应用 | 第15-16页 |
| 1.3 醛酮还原酶概述 | 第16-19页 |
| 1.3.1 醛酮还原酶 | 第16-17页 |
| 1.3.2 醛酮还原酶结构 | 第17-18页 |
| 1.3.3 醛酮还原酶催化机制 | 第18页 |
| 1.3.4 不对称还原合成手性醇中醛酮还原酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.4 阿托伐他汀药物关键中间体及其研究现状 | 第19-21页 |
| 1.4.1 阿托伐他汀及其手性侧链中间体 | 第19-20页 |
| 1.4.2 阿托伐他汀钙手性关键中间体研究现状 | 第20-21页 |
| 1.5 本论文选题意义及研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 醛酮还原酶产生菌筛选及基因工程菌的构建、表达 | 第23-42页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料与方法 | 第23-34页 |
| 2.2.1 土壤及菌株 | 第23页 |
| 2.2.2 质粒 | 第23-24页 |
| 2.2.3 主要实验仪器 | 第24-25页 |
| 2.2.4 培养基 | 第25页 |
| 2.2.5 主要工具酶和试剂 | 第25-26页 |
| 2.2.6 蛋白凝胶电泳试剂的配制方法 | 第26页 |
| 2.2.7 菌种筛选 | 第26-28页 |
| 2.2.8 醛酮还原酶在大肠杆菌中的表达 | 第28-33页 |
| 2.2.9.醛酮还原酶诱导表达 | 第33页 |
| 2.2.10 重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第33-34页 |
| 2.2.11 重组菌的粗酶液制备及酶活检测 | 第34页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第34-41页 |
| 2.3.1 菌种筛选 | 第34-37页 |
| 2.3.1.1 筛选 | 第34-35页 |
| 2.3.1.2 菌种鉴定 | 第35-37页 |
| 2.3.2 醛酮还原酶基因工程菌构建 | 第37-41页 |
| 2.3.2.1 目的基因筛选及克隆 | 第37页 |
| 2.3.2.2 重组表达载体的构建 | 第37-39页 |
| 2.3.2.3 重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第39页 |
| 2.3.2.4 表达产物SDS-PAGE分析 | 第39-40页 |
| 2.3.2.5 醛酮还原酶活力的测定 | 第40-41页 |
| 2.4 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 E.coli BL21(DE3)/ pET-28a-Caakr培养条件的研究及优化 | 第42-55页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 材料与方法 | 第42-45页 |
| 3.2.1 菌种 | 第42-43页 |
| 3.2.2 试剂 | 第43页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第43页 |
| 3.2.4 培养基 | 第43-44页 |
| 3.2.5 培养方法 | 第44页 |
| 3.2.6 细胞生长测定 | 第44页 |
| 3.2.7 生物量测定 | 第44页 |
| 3.2.8 粗酶液制备 | 第44页 |
| 3.2.9 醛酮还原酶比活力测定 | 第44-45页 |
| 3.2.10 培养条件考察及优化 | 第45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-54页 |
| 3.3.1 标准曲线绘制 | 第45-46页 |
| 3.3.2 种子生长曲线绘制 | 第46页 |
| 3.3.3 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-Caakr培养条件的研究及优化 | 第46-54页 |
| 3.3.3.1 碳源的影响 | 第46-48页 |
| 3.3.3.2 氮源的影响 | 第48-50页 |
| 3.3.3.3 磷酸盐的影响 | 第50页 |
| 3.3.3.4 金属离子的影响 | 第50-51页 |
| 3.3.3.5 接种量的影响 | 第51-52页 |
| 3.3.4.6 诱导温度的影响 | 第52页 |
| 3.3.3.7 诱导剂浓度的影响 | 第52-53页 |
| 3.3.3.8 诱导剂诱导时间的影响 | 第53-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第四章 重组醛酮还原酶的分离纯化及酶学特性研究 | 第55-75页 |
| 4.1 引言 | 第55-56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-62页 |
| 4.2.1 菌株 | 第56页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第56页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第56页 |
| 4.2.4 培养基 | 第56-57页 |
| 4.2.5 培养方法 | 第57页 |
| 4.2.6 粗酶液制备 | 第57页 |
| 4.2.7 分析方法 | 第57-58页 |
| 4.2.8 重组醛酮还原酶的分离纯化 | 第58-59页 |
| 4.2.9 重组醛酮还原酶学性质研究 | 第59-61页 |
| 4.2.10 重组醛酮还原酶动力学研究 | 第61-62页 |
| 4.2.11 同源建模及催化作用研究 | 第62页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第62-74页 |
| 4.3.1 重组醛酮还原酶的分离纯化 | 第62-64页 |
| 4.3.2 重组醛酮还原酶的酶学特性 | 第64-69页 |
| 4.3.2.1 最适pH的测定 | 第64-65页 |
| 4.3.2.2 pH稳定性 | 第65-66页 |
| 4.3.2.3 最适温度的测定 | 第66页 |
| 4.3.2.4 热稳定性 | 第66-67页 |
| 4.3.2.5 金属离子和表面活性剂的影响 | 第67-68页 |
| 4.3.2.6 重组醛酮还原酶的底物特异性 | 第68-69页 |
| 4.3.3 重组醛酮还原酶酶学动力学研究 | 第69-72页 |
| 4.3.3.1 初始底物浓度对反应速度影响 | 第69-70页 |
| 4.3.3.2 双倒数法求解 | 第70-72页 |
| 4.3.4 同源建模及分析 | 第72-74页 |
| 4.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 第五章 结论与展望 | 第75-77页 |
| 5.1 结论 | 第75-76页 |
| 5.2 展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
