| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-22页 |
| 1.1 人乳头瘤病毒(HPV)的简介 | 第11-12页 |
| 1.1.1 HPV的分类 | 第11页 |
| 1.1.2 HPV与宫颈癌的研究进展 | 第11-12页 |
| 1.2 HPV基因和蛋白的功能 | 第12-13页 |
| 1.2.1 HPV-16基因的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 HPV基因产物的功能 | 第13页 |
| 1.3 HPV E6、E7及其突变的简介 | 第13-18页 |
| 1.3.1 HPV E6蛋白的结构 | 第13-14页 |
| 1.3.2 HPV E6蛋白的功能 | 第14-16页 |
| 1.3.3 HPV E7蛋白的结构和功能 | 第16-17页 |
| 1.3.4 HPV E6/E7蛋白的选择性剪切与宫颈癌的关系 | 第17-18页 |
| 1.4 E6型突变体对于宫颈癌的影响 | 第18-19页 |
| 1.5 细胞穿膜肽的简介 | 第19-21页 |
| 1.5.1 穿膜肽的应用价值 | 第19页 |
| 1.5.2 穿膜肽的性质和分类 | 第19-20页 |
| 1.5.3 穿膜肽的跨膜机制 | 第20页 |
| 1.5.4 穿膜肽TAT/R9的性质特点 | 第20-21页 |
| 1.6 本课题研究的目的和意义 | 第21-22页 |
| 第2章 HPV18-E6及其突变体的真核表达载体构建 | 第22-36页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.2.1 细胞,菌株及质粒表 | 第22-23页 |
| 2.2.2 试剂与药品 | 第23-24页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第24页 |
| 2.2.4 培养基 | 第24页 |
| 2.2.5 缓冲液 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.3.1 HeLa细胞基因组抽提 | 第25页 |
| 2.3.2 HPV18-E6基因的引物设计 | 第25-26页 |
| 2.3.3 重叠PCR方法进行HPV18-E6的点突变 | 第26页 |
| 2.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2.3.5 DNA电泳凝胶回收 | 第27页 |
| 2.3.6 目的片段与克隆载体连接 | 第27页 |
| 2.3.7 目的基因的双酶切 | 第27页 |
| 2.3.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.3.9 大肠杆菌的转化 | 第28页 |
| 2.3.10 质粒抽提 | 第28-29页 |
| 2.3.11 重组质粒的鉴定 | 第29页 |
| 2.3.12 重组质粒的测序和分析 | 第29页 |
| 2.4 结果与分析 | 第29-35页 |
| 2.4.1 HPV18-E6编码基因的扩增与鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4.2 HPV18-E6F49R、HPV18-E6F127R突变体基因的扩增与克隆载体的构建 | 第30-33页 |
| 2.4.3 重组质粒pcDNA3.1-E6、pcDNA3.1-E6F49R、pcDNA3.1-E6F127R和pEGFP-C1-E6、pEGFP-C1-E6F49R、pEGFP-C1-E6F127R的构建 | 第33页 |
| 2.4.4 HPV18-E6F49R-F127R双突变体重组质粒的构建 | 第33-35页 |
| 2.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 第3章 重组真核质粒对转染细胞的生长影响 | 第36-48页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.2.1 细胞株 | 第36页 |
| 3.2.2 仪器 | 第36页 |
| 3.2.3 试剂及溶液配制 | 第36-37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-40页 |
| 3.3.1 细胞复苏 | 第37页 |
| 3.3.2 细胞传代 | 第37页 |
| 3.3.3 细胞冻存 | 第37页 |
| 3.3.4 无内毒素质粒抽提步骤 | 第37-38页 |
| 3.3.5 贴壁细胞的转染 | 第38页 |
| 3.3.6 MTT法检测细胞存活率 | 第38-39页 |
| 3.3.7 AO/EB双染检测细胞凋亡 | 第39页 |
| 3.3.8 Trizol法抽提HeLa细胞总RNA | 第39页 |
| 3.3.9 RNA反转录 | 第39页 |
| 3.3.10 稳定转染细胞株的筛选 | 第39-40页 |
| 3.3.11 生长曲线绘制 | 第40页 |
| 3.4 结果与分析 | 第40-46页 |
| 3.4.1 两种HeLa细胞中HPV18-E6转录水平分析 | 第40-41页 |
| 3.4.2 重组质粒在表达全长HPV18-E6的肿瘤细胞中的表达及MTT实验 | 第41-43页 |
| 3.4.3 重组质粒在只表达HPV18-E6截短体的HeLa细胞内的表达 | 第43-44页 |
| 3.4.4 AO/EB双染荧光显微镜下观察重组质粒的促凋亡效应 | 第44-45页 |
| 3.4.5 稳定转染重组质粒的Hela细胞生长曲线的绘制 | 第45-46页 |
| 3.5 本章小结 | 第46-48页 |
| 第4章 可跨膜HPV18-E6F49R突变体蛋白克隆、表达与纯化及对肿瘤细胞生长的影响 | 第48-62页 |
| 4.1 引言 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 重组蛋白的镍柱亲和层析纯化 | 第48页 |
| 4.2.2 重组蛋白的硫酸铵沉淀粗纯化 | 第48-49页 |
| 4.2.3 实验溶液的配制 | 第49页 |
| 4.3 结果与分析 | 第49-61页 |
| 4.3.1 HPV18-E6F49R-TAT和HPV18-E6F49R-R9原核表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.3.2 HPV18-E6F49R-TAT和HPV18-E6F49R-R9在大肠杆菌中的表达及优化 | 第50-54页 |
| 4.3.2.1 温度对目的蛋白可溶性表达的影响 | 第50-51页 |
| 4.3.2.2 诱导剂浓度对目的蛋白可溶性表达的影响 | 第51-52页 |
| 4.3.2.3 诱导时间对目的蛋白可溶性表达的影响 | 第52-53页 |
| 4.3.2.4 锌离子浓度对目的蛋白可溶性表达的影响 | 第53-54页 |
| 4.3.3 目的蛋白的纯化 | 第54-60页 |
| 4.3.3.1 镍柱亲和层析 | 第54页 |
| 4.3.3.2 硫酸铵沉淀 | 第54-56页 |
| 4.3.3.3 离子交换层析 | 第56-59页 |
| 4.3.3.4 锌离子柱亲和层析 | 第59-60页 |
| 4.3.4 HPV18E6F49R-TAT和HPV18E6F49R-R9对Hela细胞增殖的影响 | 第60-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第5章 总结与展望 | 第62-65页 |
| 5.1 总结 | 第62-63页 |
| 5.2 展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
