| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 英文缩写表 | 第6-9页 |
| 1 引言 | 第9-11页 |
| 2 试验材料 | 第11-13页 |
| 2.1 试验仪器 | 第11页 |
| 2.2 供试试剂 | 第11页 |
| 2.3 试验材料 | 第11页 |
| 2.4 试验涉及的培养基及侵染液 | 第11-13页 |
| 3 试验方法 | 第13-25页 |
| 3.1 植物材料的培养及取样 | 第13页 |
| 3.2 5’ RACE 技术获得目的基因 CDS | 第13-16页 |
| 3.2.1 植物总 RNA 的提取 | 第13页 |
| 3.2.2 总 RNA 的纯化 | 第13-14页 |
| 3.2.3 总 RNA 的检测 | 第14页 |
| 3.2.4 cDNA 的合成 | 第14页 |
| 3.2.5 5’ RACE PCR 引物设计 | 第14-15页 |
| 3.2.6 5’ RACE PCR | 第15页 |
| 3.2.7 PCR 产物回收 | 第15-16页 |
| 3.2.8 目的基因与 T 载体连接 | 第16页 |
| 3.2.9 重组质粒的转化 | 第16页 |
| 3.2.10 克隆的蓝白斑筛选及测序 | 第16页 |
| 3.2.11 基因 CDS 全长的获得及生物信息学分析 | 第16页 |
| 3.3 实时定量 PCR 分析目的基因在小麦与叶锈菌互作中的表达变化 | 第16-19页 |
| 3.3.1 RNA 的提取、纯化及 cDNA 的合成 | 第16页 |
| 3.3.2 内参基因和目的基因引物的设计 | 第16-17页 |
| 3.3.3 实时荧光定量 PCR | 第17-18页 |
| 3.3.4 标准曲线的绘制及基因扩增效率 | 第18页 |
| 3.3.5 数据的处理及分析 | 第18-19页 |
| 3.4 TaEDS1 基因洋葱表皮定位 | 第19-22页 |
| 3.4.1 TaEDS1‐GFP 载体构建 | 第19-21页 |
| 3.4.2 重组质粒的转化与转化后检测 | 第21页 |
| 3.4.3 荧光显微镜检测 | 第21-22页 |
| 3.5 VIGS 载体的构建 | 第22页 |
| 3.6 体外转录及转录产物的侵染 | 第22-25页 |
| 3.6.1 质粒的提取 | 第22页 |
| 3.6.2 载体的酶切 | 第22-23页 |
| 3.6.3 酶切产物回收纯化 | 第23页 |
| 3.6.4 体外转录 | 第23页 |
| 3.6.5 体外转录产物的侵染 | 第23-24页 |
| 3.6.6 BSMV 侵染后 RT‐PCR 检测目的基因沉默效率 | 第24-25页 |
| 4 试验结果 | 第25-41页 |
| 4.1 TaEDS1 CDS 的获得 | 第25-28页 |
| 4.1.1 总 RNA 的完整性、含量及纯度检测 | 第25页 |
| 4.1.2 5’ RACE PCR 及 TaEDS1 CDS 的获得 | 第25-27页 |
| 4.1.3 TaEDS1 生物信息学分析 | 第27-28页 |
| 4.2 实时定量 PCR 内参基因的筛选 | 第28-33页 |
| 4.2.1 引物特异性和 PCR 扩增效率分析 | 第28-29页 |
| 4.2.2 候选内参基因的表达水平 | 第29-30页 |
| 4.2.3 GeNorm 软件分析 | 第30-31页 |
| 4.2.4 NormFinder 软件分析 | 第31页 |
| 4.2.5 内参基因表达稳定性对目的基因表达分析准确性的影响 | 第31-33页 |
| 4.3 在小麦受叶锈菌侵染过程中 TaEDS1 和 TaPAD4 的表达分析 | 第33-34页 |
| 4.4 TaEDS1 的亚细胞定位 | 第34-36页 |
| 4.4.1 重组质粒 pMD19‐T‐TaEDS1 构建与酶切鉴定 | 第34-35页 |
| 4.4.2 克隆质粒的测序 | 第35页 |
| 4.4.3 重组质粒 TaEDS1‐GFP 的酶切鉴定 | 第35页 |
| 4.4.5 重组质粒的转化与定位分析 | 第35-36页 |
| 4.5 构建 TaEDS1 的 VIGS 载体 | 第36-38页 |
| 4.5.1 PCR 扩增 TaEDS1 基因特定区域 | 第36-37页 |
| 4.5.2 重组质粒 pMD19‐T‐TaEDS1 构建与酶切鉴定 | 第37页 |
| 4.5.3 重组质粒的测序 | 第37-38页 |
| 4.5.4 终载体 BSMV‐TaEDS1 的酶切鉴定 | 第38页 |
| 4.6 BSMV 病毒侵染小麦叶片并检测沉默效率 | 第38-41页 |
| 4.6.1 体外转录 | 第38-39页 |
| 4.6.2 叶片沉默效率的检测 | 第39-41页 |
| 5 讨论 | 第41-43页 |
| 5.1 含高 GC 基因 PCR 扩增条件的优化 | 第41页 |
| 5.2 实时定量 PCR 内参基因的筛选 | 第41-42页 |
| 5.3 TaEDS1 在小麦抵抗叶锈菌侵染中的功能研究展望 | 第42-43页 |
| 6 结论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-47页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第47-48页 |
| 作者简历 | 第48-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
