| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 一、前言 | 第13-21页 |
| 1.1 CIPKs激酶参与植物生物和非生物胁迫反应的研究 | 第13-17页 |
| 1.2 乙烯的合成及参与植物发育功能的研究 | 第17-20页 |
| 1.2.1 乙烯的合成研究 | 第17-18页 |
| 1.2.2 乙烯信号的转导 | 第18-19页 |
| 1.2.3 ACC氧化酶的功能研究进展 | 第19-20页 |
| 1.3 立题依据和研究意义 | 第20-21页 |
| 二、实验材料和试剂 | 第21-27页 |
| 2.1 植物材料 | 第21页 |
| 2.2 实验中使用的菌株和相关载体 | 第21页 |
| 2.3 实验所需的生物酶 | 第21页 |
| 2.4 化学试剂及其他材料 | 第21页 |
| 2.5 常用的储存液 | 第21-25页 |
| 2.6 常用的培养基 | 第25-26页 |
| 2.7 实验所用仪器设备 | 第26-27页 |
| 三、实验方法 | 第27-40页 |
| 3.1 拟南芥种子的筛选和种植 | 第27页 |
| 3.2 拟南芥RNA的提取、消化、逆转录(实验所用耗材均需DEPC水处理) | 第27-28页 |
| 3.3 基因的扩增 | 第28-29页 |
| 3.4 酵母双杂交筛选AtCIPKL互作蛋白 | 第29-30页 |
| 3.4.1 构建相关质粒 | 第29页 |
| 3.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备并转化感受态细胞 | 第29-30页 |
| 3.5 pGBKT7-AtCIPKL自激活实验及毒性检测 | 第30-31页 |
| 3.5.1 酵母细胞感受态的制备及质粒转化酵母感受态细胞 | 第30页 |
| 3.5.2 AtCIPKL诱饵蛋白的自激活检测 | 第30页 |
| 3.5.3 毒性检测 | 第30-31页 |
| 3.6 酵母结合实验筛选互作蛋白 | 第31-33页 |
| 3.6.1 诱饵细胞与宿主文库细胞的结合 | 第31页 |
| 3.6.2 结合效率的测定 | 第31页 |
| 3.6.3 阳性克隆的鉴定 | 第31-32页 |
| 3.6.4 回交实验验证相互作用 | 第32页 |
| 3.6.5 对筛选蛋白的分析 | 第32-33页 |
| 3.7 AtCIPKL过量表达载体的构建及拟南芥转化 | 第33页 |
| 3.7.1 AtCIPKL过量表达载体的构建 | 第33页 |
| 3.7.2 PMD-AtCIPKL质粒转化农杆菌 | 第33页 |
| 3.7.3 拟南芥的遗传转化 | 第33页 |
| 3.7.4 拟南芥转基因阳性苗的鉴定和种子的收取 | 第33页 |
| 3.8 AtCPKL过量表达拟南芥及CIPKL插入突变体植株的表型分析 | 第33-34页 |
| 3.9 体内乙烯和花青素含量的测定 | 第34页 |
| 3.9.1 气态乙烯含量的测定 | 第34页 |
| 3.9.2 花青素含量的测定 | 第34页 |
| 3.10 AtCIPKL基因在拟南芥中表达模式的分析 | 第34-35页 |
| 3.10.1 拟南芥AtCIPKL启动子的调取 | 第34页 |
| 3.10.2 构建AtCIPKL：GUS融合表达载体 | 第34-35页 |
| 3.10.3 阳性苗的GUS活性鉴定 | 第35页 |
| 3.10.4 不同激素处理下AtCIPKL在拟南芥中表达模式的变化 | 第35页 |
| 3.11 AtCIPKL基因的亚细胞定位 | 第35-36页 |
| 3.11.1 AtCIPKL-GFP融合载体的构建 | 第35页 |
| 3.11.2 烟草下表皮注射观察亚细胞定位 | 第35-36页 |
| 3.12 AtCIPKL和AtACO2蛋白相互作用验证 | 第36页 |
| 3.12.1 酵母双杂交实验验证相互作用 | 第36页 |
| 3.12.2 BiFC实验验证 | 第36页 |
| 3.13 AtCIPKL和AtACO2蛋白纯化 | 第36-40页 |
| 3.13.1 蛋白表达载体的构建 | 第36页 |
| 3.13.2 目的蛋白的诱导和表达检测 | 第36-38页 |
| 3.13.3 MBP标签蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 3.13.4 His标签蛋白的大量纯化 | 第39-40页 |
| 四、实验结果 | 第40-58页 |
| 4.1 AtCIPKL基因启动子分析 | 第40-42页 |
| 4.1.1 AtCIPKL启动子的克隆和pBI101-AtCIPKLP载体的构建 | 第40页 |
| 4.1.2 pBI101-AtCIPKLP转化拟南芥 | 第40-41页 |
| 4.1.3 AtCIPKL启动子在不同处理下的活性变化分析 | 第41-42页 |
| 4.2 AtCIPKL基因的提取 | 第42页 |
| 4.3 拟南芥AtCIPKL过量表达载体的构建拟南芥的遗传转化 | 第42-44页 |
| 4.3.1 拟南芥AtCIPKL过量表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 4.3.2 转基因拟南芥的获得 | 第43-44页 |
| 4.4 AtCIPKL过量表达转基因的表型分析 | 第44-47页 |
| 4.5 AtCIPKL的亚细胞定位 | 第47-48页 |
| 4.5.1 pBI121-AtCIPKL：GFP融合载体的构建 | 第47-48页 |
| 4.5.2 烟草下表皮注射观察荧光表达 | 第48页 |
| 4.6 酵母双杂交筛选AtCPKL互作蛋白 | 第48-53页 |
| 4.6.1 酵母自激活实验及毒性检测 | 第48-50页 |
| 4.6.2 插入片段大小的确定 | 第50-51页 |
| 4.6.3 回交实验验证互作蛋白 | 第51页 |
| 4.6.4 互作蛋白的测序和序列比对分析 | 第51-53页 |
| 4.7 AtCIPKL和AtACO2相互作用 | 第53-54页 |
| 4.7.1 pGADT7-AtACO2载体的构建 | 第53页 |
| 4.7.2 酵母双杂交实验验证 | 第53-54页 |
| 4.7.3 BiFC实验验证相互作用 | 第54页 |
| 4.8 AtCIPKL和AtACO2的蛋白诱导和纯化 | 第54-58页 |
| 4.8.1 蛋白表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 4.8.2 蛋白诱导表达检测 | 第55-57页 |
| 4.8.3 Western杂交检测目的标签蛋白 | 第57-58页 |
| 五、讨论 | 第58-60页 |
| 5.1 酵母双杂交筛选与AtCIPKI互作蛋白 | 第58页 |
| 5.2 AtCIPKL参与到乙烯合成 | 第58-59页 |
| 5.3 油菜素内酯调控AtCIPKL的表达 | 第59页 |
| 5.4 AtCIPKL通过与AtACO2相互作用 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 硕士期间参与发表的论文 | 第67-68页 |
| 附录 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
