| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第8-14页 |
| 1.1 腐乳及其白点简介 | 第8-9页 |
| 1.1.1 腐乳介绍 | 第8页 |
| 1.1.2 腐乳发酵微生物 | 第8页 |
| 1.1.3 腐乳白点介绍 | 第8-9页 |
| 1.1.4 白点产生机理 | 第9页 |
| 1.2 羧肽酶概述 | 第9-13页 |
| 1.2.1 羧肽酶定义与分类 | 第9-10页 |
| 1.2.2 羧肽酶的来源 | 第10-11页 |
| 1.2.3 羧肽酶的基因工程研究 | 第11-12页 |
| 1.2.4 羧肽酶的应用 | 第12-13页 |
| 1.3 本论文的研究意义与内容 | 第13-14页 |
| 1.3.1 立题依据及意义 | 第13页 |
| 1.3.2 主要研究内容 | 第13-14页 |
| 第二章 材料与方法 | 第14-26页 |
| 2.1 材料 | 第14-17页 |
| 2.1.1 菌种、质粒、腐乳与引物 | 第14页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第14-15页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第15页 |
| 2.1.4 培养基 | 第15-16页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第16-17页 |
| 2.2 腐乳白点与发酵液中氨基酸检测方法 | 第17页 |
| 2.2.1 腐乳白点干燥 | 第17页 |
| 2.2.2 腐乳白点成份检测 | 第17页 |
| 2.2.3 腐乳发酵液中氨基酸检测 | 第17页 |
| 2.3 雅致放射毛霉的分离鉴定与CPY基因的调取 | 第17-21页 |
| 2.3.1 腐乳微生物的分离、纯化方法 | 第17-18页 |
| 2.3.2 细菌革兰氏染色方法 | 第18页 |
| 2.3.3 毛霉菌种鉴定 | 第18-19页 |
| 2.3.4 雅致放射毛霉中羧肽酶酶活检测方法 | 第19页 |
| 2.3.5 CPY部分基因序列扩增 | 第19-21页 |
| 2.3.6 CPY基因全长信息获取方法 | 第21页 |
| 2.4 重组酶的表达、纯化与体外激活方法 | 第21-25页 |
| 2.4.1 序列分析 | 第21-22页 |
| 2.4.2 基因克隆载体构建 | 第22页 |
| 2.4.3 PCR产物纯化 | 第22页 |
| 2.4.4 克隆质粒pET-22b(+)-cpy构建 | 第22页 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 2.4.6 大肠杆菌感受态细胞的转化与验证 | 第23页 |
| 2.4.7 质粒的提取 | 第23页 |
| 2.4.8 重组菌E. coli Rosetta/pET-22b(+)-procpy的构建 | 第23页 |
| 2.4.9 重组菌E. coli Rosetta/pET-22b(+)-procpy的表达 | 第23页 |
| 2.4.10 毕赤酵母表达质粒pPIC9K-procpy的构建 | 第23页 |
| 2.4.11 表达质粒pPIC9K-procpy电转化P. pastoris GS115 | 第23-24页 |
| 2.4.12 毕赤酵母多克隆转化子的筛选和鉴定 | 第24页 |
| 2.4.13 重组羧肽酶Y酶原基因在P. pastoris GS115中的表达 | 第24页 |
| 2.4.14 毕赤酵母表达酶原的分离纯化与体外激活 | 第24-25页 |
| 2.5 重组成熟酶的酶学性质分析 | 第25-26页 |
| 2.5.1 最适温度的测定 | 第25页 |
| 2.5.2 最适pH的测定 | 第25页 |
| 2.5.3 热稳定性的测定 | 第25页 |
| 2.5.4 pH稳定性的测定 | 第25-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-42页 |
| 3.1 腐乳白点与发酵液氨基酸检测 | 第26-27页 |
| 3.1.1 腐乳白点氨基酸检测 | 第26页 |
| 3.1.2 腐乳后发酵前后期上清中氨基酸变化 | 第26-27页 |
| 3.2 雅致放射毛霉的分离鉴定与CPY基因的调取 | 第27-35页 |
| 3.2.1 腐乳微生物的分离、纯化 | 第27-29页 |
| 3.2.2 毛霉基因组提取 | 第29页 |
| 3.2.3 毛霉菌种鉴定 | 第29-31页 |
| 3.2.4 雅致放射毛霉羧肽酶酶活检测 | 第31-32页 |
| 3.2.5 雅致放射毛霉总RNA提取 | 第32-33页 |
| 3.2.6 CPY部分基因扩增 | 第33-34页 |
| 3.2.7 CPY基因全长获取 | 第34页 |
| 3.2.8 CPY序列比对分析 | 第34-35页 |
| 3.3 重组羧肽酶Y酶原基因在大肠杆菌中的表达 | 第35-36页 |
| 3.3.1 表达质粒pET-22b(+)-procpy的构建 | 第35-36页 |
| 3.3.2 重组酶的表达 | 第36页 |
| 3.4 重组羧肽酶Y酶原基因在毕赤酵母中的表达 | 第36-39页 |
| 3.4.1 密码子优化 | 第36页 |
| 3.4.2 毕赤酵母表达质粒pPIC9K-procpy的构建 | 第36页 |
| 3.4.3 重组毕赤酵母的构建与高拷贝重组子筛选 | 第36-38页 |
| 3.4.4 重组毕赤酵母生长曲线 | 第38页 |
| 3.4.5 重组酶体外激活、纯化与酶活检测 | 第38-39页 |
| 3.5 成熟酶的酶学性质分析 | 第39-42页 |
| 3.5.1 最适反应温度 | 第39页 |
| 3.5.2 最适反应pH | 第39-40页 |
| 3.5.3 热稳定性 | 第40页 |
| 3.5.4 pH稳定性 | 第40-42页 |
| 主要结论与展望 | 第42-43页 |
| 主要结论 | 第42页 |
| 展望 | 第42-43页 |
| 致谢 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-48页 |
| 附录 | 第48-52页 |
| 附录 1：毛霉的ITS序列 | 第48-49页 |
| 附录 2：羧肽酶Y部分基因序列 | 第49-50页 |
| 附录 3：羧肽酶Y基因全长序列 | 第50-51页 |
| 附录 4：羧肽酶Y酶原基因优化序列 | 第51-52页 |
| 附录 5：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第52页 |
