| 中文摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第14-28页 |
| ·菌寄生研究现状与进展 | 第14-16页 |
| ·疏水蛋白的研究现状与进展 | 第16-17页 |
| ·疏水蛋白的性质 | 第16页 |
| ·疏水蛋白在不同物相之间的互动组装 | 第16-17页 |
| ·疏水蛋白的功能 | 第17页 |
| ·轮枝镰孢菌疏水蛋白的研究现状与进展 | 第17-18页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的研究现状与进展 | 第18-21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母生物学和遗传学特点 | 第18页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的构成 | 第18-20页 |
| ·宿主菌株 | 第18-19页 |
| ·表达载体 | 第19-20页 |
| ·表达外源基因的机制 | 第20-21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 | 第21页 |
| ·镍柱亲和层析 | 第21-22页 |
| ·植物病原基因敲除功能研究现状与进展 | 第22-23页 |
| ·轮枝镰孢菌遗传转化系统的研究现状与进展 | 第23-25页 |
| ·根癌农杆菌 | 第23页 |
| ·农杆菌Ti质粒的结构 | 第23页 |
| ·根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理 | 第23-24页 |
| ·根癌农杆菌介导丝状真菌转化的特点 | 第24-25页 |
| ·选题的目的意义、研究内容和技术路线 | 第25-28页 |
| ·目的意义 | 第25-26页 |
| ·研究内容 | 第26-27页 |
| ·技术路线 | 第27-28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-54页 |
| ·材料 | 第28-32页 |
| ·供试菌株 | 第28页 |
| ·菌株与质粒 | 第28页 |
| ·主要生化和分子生物学试剂、酶 | 第28页 |
| ·仪器 | 第28-29页 |
| ·培养基 | 第29-30页 |
| ·溶液配制 | 第30-32页 |
| ·实验方法 | 第32-54页 |
| ·轮枝镰孢菌孢子表面蛋白的提取方法 | 第32-33页 |
| ·菌种培养 | 第32页 |
| ·疏水蛋白的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第33页 |
| ·N-端氨基酸测序 | 第33页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因克隆表达与功能分析 | 第33-47页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因的克隆 | 第33-38页 |
| ·F.verticillioide总RNA的提取(Trizol法)及检测 | 第33-34页 |
| ·反转录cDNA第一链的合成 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因cDNA全长克隆 | 第35-36页 |
| ·PCR产物回收 | 第36页 |
| ·载体连接 | 第36-37页 |
| ·大肠杆菌E.coli感受态细胞的制备和转化 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌E.coli感受态的制备 | 第37页 |
| ·大肠杆菌E.coli感受态的转化 | 第37-38页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因序列测定 | 第38页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因全长序列的生物信息学分析 | 第38页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因成熟肽基因序列的分离 | 第38-41页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因成熟肽序列的限制性酶切位点分析 | 第38页 |
| ·引物设计 | 第38-39页 |
| ·质粒提取 | 第39-40页 |
| ·质粒DNA的双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因序列测定 | 第41页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因在毕赤酵母中的表达 | 第41-44页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第41页 |
| ·线性化质粒DNA制备 | 第41-42页 |
| ·线性化酶切 | 第41-42页 |
| ·线状质粒DNA的纯化 | 第42页 |
| ·酵母转化 | 第42-44页 |
| ·Pichia pastoris GS115感受态细胞的制备(电击法) | 第42-43页 |
| ·重组表达质粒电击转化感受态酵母GS115细胞 | 第43页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第43页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因的表达与产物纯化 | 第44-47页 |
| ·酵母工程菌的培养及HydⅠ、HydⅡ基因的诱导分泌表达 | 第44-45页 |
| ·表达产物hydrophobinⅠ、hydrophobinⅡ的纯化 | 第45-47页 |
| ·蛋白样品的预处理 | 第45页 |
| ·Ni-NTA亲和层析纯化 | 第45页 |
| ·表达产物纯化后蛋白制品SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第46-47页 |
| ·F.verticillioide hydrophobinⅠ、hydrophobinⅡ对孢子凝集作用的研究 | 第47页 |
| ·pH值对孢子凝聚的影响 | 第47页 |
| ·根癌农杆菌介导轮枝镰孢遗传转化所用转化载体的构建 | 第47-54页 |
| ·突变载体的构建 | 第47-50页 |
| ·构建策略及流程 | 第47-49页 |
| ·HydⅡ基因上下游基因序列的PCR扩增 | 第49页 |
| ·重组 | 第49-50页 |
| ·pUCATPH-X-S与pROKⅡ的重构 | 第50-52页 |
| ·构建策略及流程 | 第51-52页 |
| ·质粒pROKⅡ和pUCATPH-X-S的双酶切 | 第52页 |
| ·连接 | 第52页 |
| ·转化大肠杆菌感受态,筛选阳性重组克隆 | 第52-54页 |
| ·大肠杆菌五.C0//感受态的制备（参照2.2.2.1.7.1) | 第52页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化（参照2.2.2.1.7.2 ) | 第52页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第52-53页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA(参照2.2.2.2.3) | 第53页 |
| ·酶切和PCR鉴定 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-85页 |
| ·F.verticillioide孢子表面疏水蛋白的提取 | 第54-55页 |
| ·SDS-PAGE电泳结果 | 第54-55页 |
| ·F.verticillioide疏水蛋白基因HydⅠ、HydⅡ克隆表达与凝聚功能分析 | 第55-79页 |
| ·HydⅠ、HydⅡ基因克隆 | 第55-64页 |
| ·总RNA的提取(Trizol法) | 第55页 |
| ·HydⅠ、HydⅡ目的基因的分离 | 第55-56页 |
| ·HydⅠ、HydⅡ基因核苷酸序列及氨基酸序列分析 | 第56-60页 |
| ·Fusarium verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因成熟肽基因序列的分离 | 第60-64页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因成熟肽序列的限制性酶切位点分析结果 | 第60页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ成熟肽基因的氨基酸序列分析 | 第60-62页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ编码序列的分离 | 第62-64页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ、HydⅡ基因在毕赤酵母中的表达 | 第64-73页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第64-70页 |
| ·表达质粒转化Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选 | 第70-73页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第70-71页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第71-72页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ和HydⅡ基因酵母多拷贝整合子的筛选 | 第72-73页 |
| ·表达产物的纯化 | 第73-75页 |
| ·疏水蛋白对孢子凝聚作用的研究 | 第75-79页 |
| ·疏水蛋白对轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢孢子凝聚作用研究 | 第75-77页 |
| ·疏水蛋白对其它孢子的凝聚作用研究 | 第77-78页 |
| ·pH对孢子凝聚作用的影响 | 第78-79页 |
| ·F.verticillioide HydⅡ基因敲除载体的构建 | 第79-85页 |
| ·HydⅡ基因全长与延伸片段的获得 | 第79-81页 |
| ·HydⅡ基因上下游片段的分离 | 第81页 |
| ·突变载体pROKⅡ-PtrpC-hph-TtrpC的构建 | 第81-83页 |
| ·第一次重组 | 第81-82页 |
| ·第二次重组 | 第82-83页 |
| ·pUCATPH-X-S与pROKⅡ的重构 | 第83-85页 |
| ·质粒pROKⅡ和pUCATPH-X-S的双酶切产物 | 第83页 |
| ·含潮霉素抗性基因的DNA片段的插入识别 | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-87页 |
| ·F.verticillioide孢子表面蛋白的提取 | 第85页 |
| ·F.verticillioide HydⅠ和HydⅡ基因的克隆表达与功能分析 | 第85-86页 |
| ·F.verticillioide HydⅡ基因敲除载体的构建 | 第86-87页 |
| 5 结论与建议 | 第87-89页 |
| ·结论 | 第87-88页 |
| ·下一步工作建议 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
