| 图形目录 | 第1-13页 |
| 表格目录 | 第13-15页 |
| 中文摘要 | 第15-18页 |
| 英文摘要 | 第18-21页 |
| 第一章 SARS病毒RdRp基因的组装及其表达质粒的构建 | 第21-52页 |
| 摘要 | 第22-23页 |
| 1 引言 | 第23-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-33页 |
| ·材料 | 第25-28页 |
| ·合成的寡核苷酸片段 | 第25-26页 |
| ·主要试剂 | 第26-27页 |
| ·质粒载体 | 第27-28页 |
| ·大肠杆菌菌种 | 第28页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第28页 |
| ·方法 | 第28-33页 |
| ·SARS病毒RdRp基因的组装 | 第28-30页 |
| ·RdRp基因真核表达质粒的构建 | 第30-32页 |
| ·RdRp基因的序列分析 | 第32-33页 |
| 3 结果 | 第33-37页 |
| ·SARS病毒RdRp基因的组装 | 第33页 |
| ·pcDNA-RdRp表达质粒的构建 | 第33-35页 |
| ·SARS病毒RdRp基因的序列分析 | 第35-37页 |
| 4 讨论 | 第37-47页 |
| ·SARS病毒基因组的生物信息学分析 | 第37-41页 |
| ·SARS病毒系统进化分析 | 第37-38页 |
| ·SARS病毒核苷酸序列分析 | 第38-41页 |
| ·SARS病毒蛋白质功能分析 | 第41页 |
| ·组装RdRp基因的其他几套技术方案 | 第41-43页 |
| ·本项技术的几个关键问题 | 第43-45页 |
| ·组装PCR技术的拓展应用 | 第45-47页 |
| 小结 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 第二章 SARS病毒RdRp基因与EGFP基因表达质粒的构建和鉴定 | 第52-92页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| 1 引言 | 第54-56页 |
| 2 材料与方法 | 第56-67页 |
| ·材料 | 第56-60页 |
| ·合成的引物 | 第56-57页 |
| ·主要试剂 | 第57页 |
| ·质粒载体 | 第57-59页 |
| ·细胞株 | 第59页 |
| ·细胞培养液 | 第59-60页 |
| ·大肠杆菌菌株 | 第60页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第60页 |
| ·仪器设备 | 第60页 |
| ·方法 | 第60-67页 |
| ·通用的基因克隆程序 | 第60-63页 |
| ·Vero E6细胞的培养 | 第63页 |
| ·Vero E6细胞的脂质体转染 | 第63-64页 |
| ·Vero E6细胞的电穿孔法转化 | 第64页 |
| ·Vero E6细胞中表达EGFP的观察 | 第64-65页 |
| ·RNA的提取 | 第65页 |
| ·RT-PCR分析 | 第65-66页 |
| ·RNA专用试剂和耗材的处理 | 第66-67页 |
| 3 结果 | 第67-81页 |
| ·表达质粒的构建 | 第67-73页 |
| ·总体设计方案 | 第67-69页 |
| ·表达质粒的构建 | 第69-73页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第73-78页 |
| ·重组质粒的酶切和PCR鉴定 | 第73-77页 |
| ·重组质粒的序列鉴定 | 第77-78页 |
| ·重组表达质粒的功能研究 | 第78-81页 |
| ·靶基因在Vero E6细胞中的转录 | 第78-79页 |
| ·重组质粒表达蛋白质的荧光显微镜分析 | 第79-81页 |
| 4 讨论 | 第81-86页 |
| ·RNAi研究中报告基因的选择 | 第81-84页 |
| ·常用的报告基因 | 第81-82页 |
| ·绿色荧光蛋白 | 第82-84页 |
| ·RNAi研究中载体的选择 | 第84-86页 |
| 小结 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 第三章 稳定表达SARS病毒Rdgp基因的细胞株的建立 | 第92-118页 |
| 1 引言 | 第94-96页 |
| 2 材料与方法 | 第96-101页 |
| ·材料 | 第96-98页 |
| ·真核表达质粒 | 第96页 |
| ·细胞株 | 第96页 |
| ·细胞培养液 | 第96页 |
| ·细胞培养常用溶液 | 第96-97页 |
| ·大肠杆菌菌种 | 第97页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第97页 |
| ·主要试剂 | 第97-98页 |
| ·方法 | 第98-101页 |
| ·细胞冻存 | 第98页 |
| ·细胞复苏 | 第98页 |
| ·细胞培养 | 第98页 |
| ·细胞的转染 | 第98页 |
| ·细胞的电转化 | 第98页 |
| ·细胞转染效率的测定 | 第98-99页 |
| ·单克隆细胞株的建立 | 第99页 |
| ·哺乳动物细胞染色体的制备 | 第99-100页 |
| ·质粒的制备 | 第100页 |
| ·质粒的线性化处理 | 第100-101页 |
| 3 结果 | 第101-110页 |
| ·细胞转染条件的优化 | 第101-104页 |
| ·DNA和SF加量及其相互比例对转染效率的影响 | 第101-102页 |
| ·转染时细胞密度对转染效率的影响 | 第102-103页 |
| ·DNA-SF复合物与细胞共同孵育的时间对转染效率的影响 | 第103页 |
| ·不同方法制备的DNA对转染效率的影响 | 第103-104页 |
| ·不同细胞株对G418敏感性的检测 | 第104-105页 |
| ·单克隆细胞株的建立 | 第105-108页 |
| ·单克隆细胞株的鉴定 | 第108-110页 |
| 4 讨论 | 第110-114页 |
| ·影响细胞转染效率的因素 | 第110-112页 |
| ·细胞的种类 | 第110页 |
| ·细胞的生长状态 | 第110-111页 |
| ·DNA和转染试剂的比例和加量 | 第111-112页 |
| ·DNA-转染试剂复合体与细胞共孵育的时间 | 第112页 |
| ·血清和抗生素的添加 | 第112页 |
| ·细胞株建立过程中的注意事项 | 第112-114页 |
| 小结 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-118页 |
| 第四章 SARS病毒RdRp基因的RNA干扰 | 第118-176页 |
| 摘要 | 第119-121页 |
| 1 引言 | 第121-123页 |
| 2 材料与方法 | 第123-139页 |
| ·材料 | 第123-126页 |
| ·siRNA的模板DNA序列和PCR引物 | 第123-125页 |
| ·主要试剂 | 第125页 |
| ·质粒 | 第125页 |
| ·细胞株 | 第125页 |
| ·细胞培养液 | 第125页 |
| ·常用溶液 | 第125-126页 |
| ·实验动物 | 第126页 |
| ·主要仪器设备 | 第126页 |
| ·实验方法 | 第126-139页 |
| ·siRNA的体外转录合成 | 第126-130页 |
| ·siRNA的Cy3标记 | 第130页 |
| ·siRNA表达盒的构建 | 第130-134页 |
| ·细胞的培养、复苏、冻存 | 第134页 |
| ·细胞的转染 | 第134-136页 |
| ·细胞中EGFP和Cy3-siRNA的观察 | 第136页 |
| ·转染效率和RNAi效果的荧光显微镜法测定 | 第136页 |
| ·Real-time quantitative RT-PCR | 第136-137页 |
| ·流式细胞仪分析RNAi结果 | 第137-138页 |
| ·小鼠体内的RNA干扰实验 | 第138-139页 |
| 3 结果 | 第139-158页 |
| ·siRNA的体外RNAi实验 | 第139-153页 |
| ·siRNA的体外转录合成 | 第139-140页 |
| ·siRNA的Cy3标记 | 第140页 |
| ·siRNA的转染效率 | 第140-141页 |
| ·Vero E6细胞中RNAi效果的荧光显微镜法检测 | 第141-143页 |
| ·Vero E6细胞中RNAi效果的定量PCR检测 | 第143-149页 |
| ·Vero E6细胞中RNAi效果的流式细胞仪检测 | 第149-152页 |
| ·3种检测方法得到的RNAi效果的比较 | 第152页 |
| ·siRNA对内源基因表达的抑制作用 | 第152-153页 |
| ·SEC的体外RNAi实验 | 第153-156页 |
| ·SEC的构建 | 第153-154页 |
| ·SEC在细胞中的RNAi作用 | 第154-156页 |
| ·siRNA的小鼠体内RNA干扰 | 第156-158页 |
| 4 讨论 | 第158-168页 |
| ·应用荧光显微镜计数法判断RNAi效果时的注意事项 | 第158-159页 |
| ·显微镜对观察结果的影响 | 第158页 |
| ·标记分子的荧光强度 | 第158-159页 |
| ·其他 | 第159页 |
| ·获得siRNA的方法 | 第159-161页 |
| ·体外转录法合成siRNA | 第159页 |
| ·siRNA表达框 | 第159-160页 |
| ·化学合成 | 第160页 |
| ·“鸡尾酒”法 | 第160页 |
| ·siRNA表达载体 | 第160-161页 |
| ·体内RNAi研究涉及的靶基因 | 第161-162页 |
| ·体内RNAi研究的基因导入途径 | 第162-163页 |
| ·尾静脉注射 | 第162页 |
| ·病毒感染体细胞 | 第162页 |
| ·移植 | 第162页 |
| ·通过转基因技术制备RNAi转基因动物 | 第162-163页 |
| ·其他 | 第163页 |
| ·基因导入的载体系统 | 第163-166页 |
| ·病毒载体系统 | 第163-164页 |
| ·非病毒载体系统 | 第164-166页 |
| ·RNAi效果的判断方法 | 第166页 |
| ·抑制SARS病毒RdRp基因表达的siRNA | 第166-168页 |
| 小结 | 第168-169页 |
| 参考文献 | 第169-176页 |
| 文献综述 SARS的研究进展 | 第176-202页 |
| 1 SARS的流行病学研究 | 第177-180页 |
| ·流行情况 | 第177页 |
| ·流行特点 | 第177-178页 |
| ·传染源 | 第178-179页 |
| ·传播途径 | 第179页 |
| ·其他 | 第179-180页 |
| 2 SARS临床研究 | 第180-189页 |
| ·临床基础研究 | 第180-186页 |
| ·临床分期及其症状 | 第186-187页 |
| ·临床治疗 | 第187-188页 |
| ·中医药在SARS治疗中的作用 | 第188-189页 |
| 3 SARS冠状病毒的基础研究 | 第189-199页 |
| ·冠状病毒简介 | 第189-190页 |
| ·SARS冠状病毒的发现和确证 | 第190-191页 |
| ·超微结构特征 | 第191-194页 |
| ·SARS病毒的复制 | 第194-195页 |
| ·SARS病毒的来源 | 第195-196页 |
| ·SARS的分子生物学研究 | 第196-199页 |
| 4 SARS的防治展望 | 第199-202页 |
| ·疫苗研究 | 第199-200页 |
| ·药物开发 | 第200-202页 |
| 参考文献 | 第202-212页 |
| 致谢 | 第212-213页 |
| 在读期间发表和待发表的论文 | 第213-214页 |
