| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-17页 |
| 本论文的缩写词汇表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-44页 |
| ·古菌概述 | 第18-20页 |
| ·Sulfolobus tokodaii strain 7介绍 | 第19-20页 |
| ·DNA损伤方式 | 第20-21页 |
| ·DNA损伤方式 | 第20-21页 |
| ·DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs) | 第21页 |
| ·DNA双链断裂修复方式 | 第21-34页 |
| ·非同源重组修复途径 | 第22-23页 |
| ·同源重组修复途径 | 第23-34页 |
| ·细菌同源重组修复途径 | 第24-27页 |
| ·真核生物同源重组修复途径 | 第27-31页 |
| ·古菌同源重组修复 | 第31-34页 |
| ·单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding protein) | 第34-36页 |
| ·核酸酶 | 第36-42页 |
| ·核酸酶分类 | 第36-37页 |
| ·核酸酶水解磷酸二酯键机制 | 第37-38页 |
| ·金属辅助因子 | 第38页 |
| ·DNA修复中各种核酸酶 | 第38-40页 |
| ·核酸酶结构 | 第40-42页 |
| ·核酸酶识别DNA底物模式 | 第42页 |
| ·本论文开展的思路 | 第42-44页 |
| 第二章 超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii核酸酶StoNurA纯化及生化性质分析 | 第44-65页 |
| ·材料与方法 | 第44-52页 |
| ·菌株与质粒 | 第44页 |
| ·试剂 | 第44页 |
| ·主要仪器设备 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44页 |
| ·主要试剂配方 | 第44-45页 |
| ·S.tokodaii基因组提取 | 第45页 |
| ·大肠杆菌DH5αBL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受细胞的制备 | 第45页 |
| ·S.tokodaii核酸酶nurA基因克隆 | 第45-47页 |
| ·PCR扩增基因片段 | 第45页 |
| ·PCR产物回收 | 第45-46页 |
| ·PCR产物或质粒双酶切反应 | 第46页 |
| ·双酶切反应片段回收 | 第46页 |
| ·DNA连接和转化 | 第46-47页 |
| ·连接反应所得阳性克隆筛选 | 第47页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第47-48页 |
| ·Western blot检测重组蛋白 | 第48-49页 |
| ·StoNurA蛋白兔多克隆抗血清的制备 | 第48-49页 |
| ·Westerll blot | 第49页 |
| ·蛋白热稳定性检测 | 第49-50页 |
| ·DNA底物准备 | 第50页 |
| ·合成寡核苷酸单链序列 | 第50页 |
| ·底物制备 | 第50页 |
| ·DNA与蛋白结合原理和检测 | 第50-51页 |
| ·DNA与蛋白结合实验原理 | 第50-51页 |
| ·DNA与蛋白结合活性检测 | 第51页 |
| ·核酸外切酶检测原理和方法 | 第51-52页 |
| ·核酸外切酶检测原理 | 第51页 |
| ·核酸外切酶检测方法 | 第51-52页 |
| ·核酸内切酶检测原理和方法 | 第52页 |
| ·核酸内切酶检测原理 | 第52页 |
| ·核酸内切酶检测方法 | 第52页 |
| ·结果与分析 | 第52-63页 |
| ·nurA基因克隆、表达和纯化 | 第52-55页 |
| ·StoNurA蛋白形成聚体大分子形式 | 第55-56页 |
| ·StoNurA蛋白热稳定性 | 第56页 |
| ·StoNurA蛋白结合活性检测 | 第56-57页 |
| ·StoNurA蛋白生化性质分析 | 第57-63页 |
| ·StoNurA蛋白核酸外切酶活性检测 | 第57-59页 |
| ·StoNurA蛋白核酸外切酶时间梯度与最适反应温度 | 第59-61页 |
| ·StoNurA对二价阳离子的依赖性 | 第61页 |
| ·NaCl对StoNurA结合活性和外切酶活性影响 | 第61-63页 |
| ·StoNurA具有单链内切酶活性 | 第63页 |
| ·小结 | 第63-65页 |
| 第三章 StoNurA蛋白结构与功能的研究 | 第65-85页 |
| ·材料与方法 | 第65-70页 |
| ·材料 | 第65页 |
| ·胰蛋白酶限制性水解实验 | 第65-66页 |
| ·蛋白质N端序列分析 | 第66页 |
| ·StoNurA蛋白缺失突变体构建 | 第66页 |
| ·StoNurA蛋白保守催化氨基酸位点突变蛋白构建 | 第66-68页 |
| ·突变体蛋白表达和纯化 | 第68-69页 |
| ·突变体蛋白活性检测 | 第69页 |
| ·底物制备 | 第69页 |
| ·DNA结合活性检测 | 第69页 |
| ·核酸外切酶活性检测 | 第69页 |
| ·StoNurA蛋白结构模式图构建 | 第69-70页 |
| ·结果与分析 | 第70-83页 |
| ·胰蛋白酶限制性水解实验 | 第70页 |
| ·N端蛋白质序列分析 | 第70-71页 |
| ·构建StoNurA蛋白缺失突变体 | 第71-72页 |
| ·StoNurA同源序列分析和点突变体构建 | 第72-74页 |
| ·StoNurA缺失突变体蛋白生化性质分析 | 第74-79页 |
| ·DNA结合活性分析 | 第74-76页 |
| ·核酸外切酶活性分析 | 第76-79页 |
| ·StoNurA点突变体蛋白核酸外切酶活性分析 | 第79-81页 |
| ·StoNurA结构模式图 | 第81-83页 |
| ·小结 | 第83-85页 |
| 第四章 StoNurA与单链结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SSB)相互作用的研究 | 第85-107页 |
| ·材料与方法 | 第85-92页 |
| ·材料 | 第85页 |
| ·构建重组质粒 | 第85-86页 |
| ·构建pET22b-StoNurA重组质粒 | 第85页 |
| ·构建pET15b-StoSSB重组质粒 | 第85-86页 |
| ·构建pET15b-TmaSSB重组质粒 | 第86页 |
| ·单链结合蛋白StoSSB和TmaSSB表达与纯化 | 第86-87页 |
| ·单链结合蛋白StoSSB表达与纯化 | 第86页 |
| ·单链结合蛋白TmaSSB表达与纯化 | 第86-87页 |
| ·StoSSB和TmaSSB蛋白单链DNA结合活性 | 第87页 |
| ·Ni-NTA琼脂糖珠pull-down | 第87页 |
| ·StoNurA与StoSSB蛋白体外结合实验 | 第87-88页 |
| ·酵母双杂交实验(yeast two-hybrid analysis) | 第88-90页 |
| ·酵母双杂交原理 | 第88-89页 |
| ·实验方法 | 第89-90页 |
| ·免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation) | 第90-92页 |
| ·免疫共沉淀原理 | 第90-91页 |
| ·免疫共沉淀实验方法 | 第91-92页 |
| ·StoSSB对StoNurA蛋白生化活性的作用 | 第92页 |
| ·底物制备 | 第92页 |
| ·StoSSB对StoNurA蛋白核酸外切酶活性的作用 | 第92页 |
| ·StoSSB对StoNurA蛋白核酸内切酶活性的作用 | 第92页 |
| ·结果与讨论 | 第92-105页 |
| ·StoNurA(不带组氨酸标签)、StoSSB和TmaSSB蛋白表达与纯化 | 第92-93页 |
| ·从S.tokodaii全蛋白中钓取可能与StoNurA相互作用蛋白 | 第93-95页 |
| ·StoSSB与StoNurA体外结合实验 | 第95-97页 |
| ·酵母双杂交实验 | 第97页 |
| ·免疫共沉淀实验 | 第97-98页 |
| ·StoNurA和StoSSB在生化性质上相互作用 | 第98-105页 |
| ·StoSSB和TmaSSB蛋白具有ssDNA结合活性 | 第98-99页 |
| ·StoSSB抑制StoNurA核酸外切酶活性 | 第99-102页 |
| ·StoSSB通过StoNurA C端与StoNurA相互作用 | 第102-105页 |
| ·StoSSB抑制StoNurA核酸内切酶活性 | 第105页 |
| ·小结 | 第105-107页 |
| 第五章 结论与展望 | 第107-110页 |
| ·结论 | 第107-108页 |
| ·展望 | 第108-110页 |
| 附录一:主要药品和试剂 | 第110-111页 |
| 附录二:本文所使用的主要仪器 | 第111-112页 |
| 附录三:本文所涉及的培养基 | 第112-113页 |
| 附录四:主要溶液配方 | 第113-114页 |
| 附录五:CaCl_2法制备感受态细胞 | 第114-115页 |
| 附录六:PCR扩增及双酶切的体系 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第133-134页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第134-135页 |
| 外文论文 | 第135-164页 |
| Part Ⅰ:Physical and functional interaction between archaeal single-stranded DNA-bindingprotein and the 5'-3'nuclease NurA | 第135-142页 |
| Part Ⅱ:Biochemical and structural domain analysis of the archaeal 5'-3'exonuclease NurA | 第142-164页 |
