| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-22页 |
| 第一章 前言 | 第22-45页 |
| ·1,3-丙二醇研究概况 | 第22-23页 |
| ·甘油脱水酶的研究概况 | 第23-30页 |
| ·甘油脱水酶的生产菌 | 第23-24页 |
| ·甘油脱水酶的作用 | 第24-25页 |
| ·甘油脱水酶基因及dha调节子 | 第25-26页 |
| ·不同来源的甘油脱水酶序列比对 | 第26页 |
| ·CoB_(12) | 第26-28页 |
| ·甘油脱水酶的激活蛋白及失活和激活机制 | 第28-29页 |
| ·甘油脱水酶的晶体结构 | 第29-30页 |
| ·微生物酶分子进化的研究情况 | 第30-43页 |
| ·酶的分子改性策略 | 第31-41页 |
| ·易错PCR技术(error-prone PCR) | 第31-32页 |
| ·定点突变和饱和突变 | 第32页 |
| ·DNA改组(DNA shuffling) | 第32-36页 |
| ·经典的DNA shuffling | 第34页 |
| ·交错延伸(stagger extension process,StEP) | 第34页 |
| ·非同源性序列间的DNA改组 | 第34-35页 |
| ·Family shuffling | 第35页 |
| ·限制性内切酶family shuffling | 第35页 |
| ·ss-DNA shuffling | 第35页 |
| ·Genome shuffling | 第35-36页 |
| ·微生物酶DNA shuffling的研究动态 | 第36-39页 |
| ·提高微生物酶的活性 | 第36页 |
| ·改变微生物酶对底物的专一性 | 第36-37页 |
| ·提高微生物酶的稳定性 | 第37-38页 |
| ·增加微生物酶的抗性 | 第38页 |
| ·增加微生物酶的pH耐受性 | 第38-39页 |
| ·外显子重组(Exon Shuffling) | 第39页 |
| ·杂合酶(hybrid enzyme) | 第39-40页 |
| ·定向进化、理性设计和计算机辅助设计的结合 | 第40-41页 |
| ·酶定向进化的筛选方法 | 第41-42页 |
| ·表形筛选方法 | 第41页 |
| ·微板筛选 | 第41页 |
| ·噬菌体展示技术(Phage display) | 第41-42页 |
| ·微生物酶定向进化及理性设计的应用前景 | 第42-43页 |
| ·课题的来源及研究的目的意义 | 第43-45页 |
| 第二章 材料和方法 | 第45-84页 |
| ·材料 | 第45-46页 |
| ·菌株及质粒 | 第45页 |
| ·酶与试剂 | 第45页 |
| ·主要仪器设备 | 第45-46页 |
| ·基本实验方法 | 第46-62页 |
| ·弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌、巴氏梭菌及产气荚膜梭菌的培养 | 第46页 |
| ·甘油富集菌的采样及培养 | 第46页 |
| ·采样 | 第46页 |
| ·甘油菌的富集培养 | 第46页 |
| ·菌株保存 | 第46页 |
| ·弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌、巴氏梭菌及产气荚膜梭菌基因组总DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·甘油富集菌宏基因组DNA的提取 | 第47-48页 |
| ·宏基因组DNA的粗提 | 第47-48页 |
| ·宏基因组DNA的纯化 | 第48页 |
| ·弗氏柠檬酸菌及克雷伯氏菌甘油脱水酶基因引物设计、扩增及表达载体构建 | 第48-49页 |
| ·PCR引物的设计 | 第48页 |
| ·PCR扩增 | 第48-49页 |
| ·表达载体构建 | 第49页 |
| ·弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因引物设计、PCR扩增及表达载体构建 | 第49-50页 |
| ·PCR引物的设计 | 第49页 |
| ·PCR扩增 | 第49-50页 |
| ·表达载体构建 | 第50页 |
| ·弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌甘油脱水酶激活因子基因引物设计、PCR扩增及表达载体构建 | 第50-51页 |
| ·PCR引物的设计 | 第50-51页 |
| ·PCR扩增 | 第51页 |
| ·表达载体构建 | 第51页 |
| ·宏基因组甘油脱水酶基因的PCR扩增及载体构建 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增 | 第51-52页 |
| ·验证及测序 | 第52页 |
| ·表达载体构建 | 第52页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第52-53页 |
| ·化学法大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第52页 |
| ·电穿孔大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第53页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第53-54页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第54页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第54-55页 |
| ·化学转化大肠杆菌感受态细胞 | 第54页 |
| ·电转化大肠杆菌JM109感受态细胞 | 第54-55页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第55页 |
| ·重组子质粒PCR验证及活力验证 | 第55页 |
| ·外源片段在大肠杆菌中的诱导表达 | 第55页 |
| ·甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶及激活因子粗酶液的制备 | 第55-56页 |
| ·生化法破胞 | 第56页 |
| ·超声波法破胞 | 第56页 |
| ·包涵体的检测 | 第56页 |
| ·表达产物的变性SDS-PAGE电泳 | 第56-57页 |
| ·表达产物的非变性胶蛋白质电泳 | 第57页 |
| ·表达产物表达量分析 | 第57页 |
| ·酶的纯化 | 第57-58页 |
| ·金属亲和层析Ni-NTA介质的再生和活化 | 第57页 |
| ·GDHt的纯化 | 第57-58页 |
| ·PDOR的纯化 | 第58页 |
| ·GDHt激活因子的纯化 | 第58页 |
| ·蛋白含量测定 | 第58页 |
| ·甘油脱水酶活力的测定 | 第58-59页 |
| ·GDHt活力测定原理 | 第59页 |
| ·测定的具体步骤 | 第59页 |
| ·酶活力的定义 | 第59页 |
| ·酶活力计算 | 第59页 |
| ·甘油脱水酶酶学性质测定 | 第59-60页 |
| ·pH对GDHt活力的影响 | 第59-60页 |
| ·温度对GDHt活力的影响 | 第60页 |
| ·GDHt的K_m及V_(max)测定 | 第60页 |
| ·GDHt的pH稳定性实验 | 第60页 |
| ·GDHt的热稳定性实验 | 第60页 |
| ·1,3-丙二醇氧化还原酶活力的测定 | 第60-61页 |
| ·测定原理 | 第60-61页 |
| ·具体步骤 | 第61页 |
| ·酶活力的定义 | 第61页 |
| ·PDOR活力的计算方法 | 第61页 |
| ·1,3-丙二醇氧化还原酶酶学性质测定 | 第61-62页 |
| ·pH值对1,3-丙二醇氧化还原酶活力的影响 | 第61-62页 |
| ·温度对1,3-丙二醇氧化还原酶的影响 | 第62页 |
| ·1,3-丙二醇氧化还原酶的K_m及V_(max)测定 | 第62页 |
| ·甘油脱水酶激活因子的激活试验 | 第62页 |
| ·GDHt失活原理和激活原理 | 第62页 |
| ·GDHt的失活方法 | 第62页 |
| ·GDHt的激活方法 | 第62页 |
| ·甘油脱水酶高通量筛选体系的建立 | 第62-64页 |
| ·反应机理 | 第62-63页 |
| ·反应溶液及指示培养基 | 第63-64页 |
| ·高通量筛选具体步骤 | 第64页 |
| ·三维结构同源建模方法 | 第64-65页 |
| ·比对分析氨基酸的同源性 | 第64-65页 |
| ·构建三维结构同源模型 | 第65页 |
| ·分析整理模型 | 第65页 |
| ·定向进化(irrational directed evolution)相关实验方法 | 第65-71页 |
| ·甘油脱水酶基因的改组(family shuffling) | 第65-69页 |
| ·Family shuffling模板基因的获得 | 第65-67页 |
| ·GDHt全长基因的获得 | 第65-66页 |
| ·GDHt大亚基基因的获得 | 第66-67页 |
| ·Family shuffling模板基因的片段化 | 第67-68页 |
| ·DNase I片段化法 | 第67-68页 |
| ·内切酶片段化法 | 第68页 |
| ·GDHt基因片段的再组装(无引物PCR) | 第68页 |
| ·GDHt全长基因及大亚基基因的扩增(有引物PCR) | 第68页 |
| ·弗氏柠檬酸菌中小亚基基因表达载体的构建 | 第68-69页 |
| ·Family shuffling突变文库的构建 | 第69页 |
| ·Family shuffling突变文库的筛选 | 第69页 |
| ·改组酶的酶学性质测定 | 第69页 |
| ·改组酶的基因测序及序列分析 | 第69页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶基因易错PCR(error-prone PCR)相关方法 | 第69-71页 |
| ·Error-prone PCR扩增模板的甲基化 | 第69页 |
| ·Error-prone PCR引物 | 第69-70页 |
| ·Error-prone PCR反应体系 | 第70页 |
| ·Error-prone PCR突变文库的构建 | 第70页 |
| ·Error-prone PCR突变文库的筛选 | 第70页 |
| ·突变酶的酶学性质测定 | 第70页 |
| ·突变酶的基因测序及序列分析 | 第70页 |
| ·野生及突变酶的3D结构建模及三维结构分析 | 第70-71页 |
| ·酶的理性设计进化(rational directed evolution)相关实验方法 | 第71-84页 |
| ·甘油脱水酶的基因杂合改组(gene swapping) | 第71-73页 |
| ·扩增模板的甲基化 | 第71页 |
| ·GDHt大亚基及中小亚基基因的获得 | 第71-72页 |
| ·甲基化质粒模板的消除 | 第72页 |
| ·理性设计和三种GDHt大亚基基因之间的杂合交换及表达载体构建 | 第72-73页 |
| ·Gene swapping重组子的筛选 | 第73页 |
| ·杂合酶的酶学性质测定 | 第73页 |
| ·杂合酶的序列分析 | 第73页 |
| ·野生酶及杂合酶的3D结构建模及三维结构分析 | 第73页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的定点突变(site mutagenesis) | 第73-78页 |
| ·定点突变方法 | 第73-75页 |
| ·重叠PCR法(Over-lap PCR) | 第74页 |
| ·反向PCR法 | 第74-75页 |
| ·突变点的选择 | 第75页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt基因定点突变PCR引物设计 | 第75-76页 |
| ·定点突变PCR扩增 | 第76-77页 |
| ·位点α-Y525E的突变扩增 | 第76-77页 |
| ·位点α-F60E的突变扩增 | 第77页 |
| ·GDHt基因定点突变载体的构建及转化 | 第77页 |
| ·位点α-Y525E载体的构建及转化 | 第77页 |
| ·位点α-F60E载体的构建及转化 | 第77页 |
| ·GDHt基因定点突变重组子的筛选验证 | 第77页 |
| ·突变酶的纯化及酶学性质测定 | 第77页 |
| ·野生酶及突变酶的3D结构建模及三维结构分析 | 第77-78页 |
| ·弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶的饱和突变 | 第78-84页 |
| ·饱和突变方法—一步反向PCR法 | 第78-79页 |
| ·饱和突变点的选择 | 第79页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变PCR引物设计 | 第79-82页 |
| ·饱和突变的PCR扩增 | 第82页 |
| ·GDHt基因饱和突变文库的构建 | 第82页 |
| ·GDHt基因饱和突变文库的筛选 | 第82页 |
| ·饱和突变酶的酶学性质测定 | 第82页 |
| ·饱和突变酶的基因测序及序列分析 | 第82-83页 |
| ·野生及饱和突变酶的3D结构建模及三维结构分析 | 第83-84页 |
| 第三章 甘油脱水酶及其相关基因的克隆表达、酶的纯化、酶学性质及结构研究 | 第84-130页 |
| ·弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因的克隆表达、序列分析、酶学性质及结构研究 | 第84-93页 |
| ·结果与分析 | 第84-91页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt基因的克隆及表达载体的构建 | 第84-85页 |
| ·C.freundii GDHt的序列分析 | 第85-86页 |
| ·dhaBCE基因表达产物的蛋白质电泳分析 | 第86-87页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt的纯化及比活力测定 | 第87-88页 |
| ·酶学性质 | 第88-89页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt三维结构分析 | 第89-91页 |
| ·讨论 | 第91-93页 |
| ·同源性 | 第91-92页 |
| ·表达与纯化 | 第92页 |
| ·酶学性质 | 第92-93页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的克隆表达、序列分析、酶学性质及结构研究 | 第93-99页 |
| ·结果与分析 | 第93-98页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt基因的克隆及表达载体的构建 | 第93-94页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt序列分析 | 第94页 |
| ·gldABC基因表达产物的蛋白质电泳分析 | 第94-95页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt的纯化及比活力测定 | 第95-96页 |
| ·酶学性质 | 第96-97页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt三维结构分析 | 第97-98页 |
| ·讨论 | 第98-99页 |
| ·宏基因组甘油脱水酶基因的克隆与表达、鉴定及结构研究 | 第99-105页 |
| ·结果与分析 | 第100-104页 |
| ·宏基因组DNA的提取 | 第100页 |
| ·宏基因组的GDHt基因的克隆及表达载体的构建 | 第100-101页 |
| ·宏基因组的GDHt的序列分析 | 第101-102页 |
| ·udhaBCE基因表达产物的SDS-PAGE分析 | 第102页 |
| ·宏基因组的GDHt的纯化及活力测定 | 第102-103页 |
| ·宏基因组GDHt的三维结构同源建模 | 第103-104页 |
| ·讨论 | 第104-105页 |
| ·弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达、序列分析、酶学性质及结构研究 | 第105-114页 |
| ·结果与分析 | 第105-111页 |
| ·dhaT 基因的克隆及表达载体的构建 | 第105-106页 |
| ·C.freundii PDOR序列分析 | 第106-107页 |
| ·外源基因表达及重组酶的纯化及比活力测定 | 第107-109页 |
| ·PDOR的酶学性质 | 第109-110页 |
| ·弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶三维结构同源建模 | 第110-111页 |
| ·讨论 | 第111-114页 |
| ·弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶基因的协同表达及产物测定 | 第114-117页 |
| ·结果与分析 | 第114-116页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt基因及1,3-丙二醇氧化还原酶基因的连接及表达载体的构建 | 第114-115页 |
| ·重组子的筛选 | 第115页 |
| ·产物的色谱分析 | 第115-116页 |
| ·讨论 | 第116-117页 |
| ·弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、协同表达和酶的纯化及激活实验 | 第117-124页 |
| ·结果与分析 | 第117-123页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt激活因子基因的克隆及表达载体的构建 | 第118页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt激活因子基因序列分析 | 第118-120页 |
| ·外源基因表达及重组酶的纯化 | 第120-121页 |
| ·GDHt的氧失活 | 第121页 |
| ·GDHt的激活实验 | 第121-122页 |
| ·弗氏柠檬酸菌DhaFG三维结构同源建模 | 第122-123页 |
| ·讨论 | 第123-124页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆表达和酶的纯化及激活实验 | 第124-130页 |
| ·结果与分析 | 第124-128页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt激活因子基因的克隆及表达载体的构建 | 第124-125页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt激活因子基因序列分析 | 第125-126页 |
| ·外源基因表达及重组酶的纯化 | 第126页 |
| ·GDHt的氧失活 | 第126-127页 |
| ·GDHt的激活及交叉激活实验 | 第127页 |
| ·克雷伯氏菌GdrAB三维结构同源建模 | 第127-128页 |
| ·讨论 | 第128-130页 |
| 第四章 甘油脱水酶的改造、纯化和酶学性质及结构研究 | 第130-177页 |
| ·甘油脱水酶高通量的筛选方法 | 第130-133页 |
| ·高通量筛选方法 | 第131-132页 |
| ·讨论 | 第132-133页 |
| ·甘油脱水酶的非理性设计 | 第133-145页 |
| ·五种不同种属的甘油脱水酶的改组(family shuffling) | 第133-137页 |
| ·结果与分析 | 第133-136页 |
| ·五种GDHt全长及大亚基基因的获得 | 第133页 |
| ·Family shuffling模板的片段化 | 第133-134页 |
| ·Family shuffling的无引物和有引物PCR及表达载体构建 | 第134-135页 |
| ·突变文库的筛选和性质测定 | 第135页 |
| ·突变酶的序列分析 | 第135-136页 |
| ·讨论 | 第136-137页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的易错PCR(error-prone PCR) | 第137-145页 |
| ·结果与分析 | 第137-144页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt基因的error-prone PCR突变文库的构建及筛选 | 第137页 |
| ·突变酶的纯化 | 第137-138页 |
| ·突变酶的序列分析 | 第138-139页 |
| ·重组野生酶及突变酶的酶学性质 | 第139-140页 |
| ·突变酶三维结构分析 | 第140-144页 |
| ·讨论 | 第144-145页 |
| ·甘油脱水酶的理性设计(rational design) | 第145-177页 |
| ·甘油脱水酶基因间的杂合改组(gene swapping) | 第145-155页 |
| ·结果与分析 | 第146-153页 |
| ·GDHt及其大、中-小亚基基因的克隆、杂合及表达载体的构建 | 第146-147页 |
| ·外源基因表达及重组杂合酶的纯化 | 第147-148页 |
| ·重组GDHt的序列分析 | 第148页 |
| ·重组GHDt及杂合酶的酶学性质 | 第148-150页 |
| ·野生型酶及杂合酶三维结构分析 | 第150-153页 |
| ·讨论 | 第153-155页 |
| ·克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的定点突变(site mutagenesis) | 第155-164页 |
| ·结果与分析 | 第155-163页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt基因突变位点 | 第155-156页 |
| ·克雷伯氏菌GDHt基因定点突变PCR | 第156页 |
| ·突变子的验证及突变酶的纯化 | 第156-157页 |
| ·野生酶及突变酶的酶学性质 | 第157-159页 |
| ·突变酶三维结构分析 | 第159-163页 |
| ·讨论 | 第163-164页 |
| ·弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因的饱和突变(saturation mutagenesis) | 第164-177页 |
| ·结果与分析 | 第164-175页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变位点 | 第164-165页 |
| ·弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变PCR | 第165-166页 |
| ·突变子筛选验证及测序 | 第166-168页 |
| ·突变型GDHt的纯化 | 第168-169页 |
| ·野生酶及突变酶的酶学性质 | 第169-170页 |
| ·突变酶三维结构分析 | 第170-175页 |
| ·讨论 | 第175-177页 |
| 第五章 结论与展望 | 第177-182页 |
| ·结论 | 第177-180页 |
| ·甘油脱水酶基因及其相关基因的克隆表达、酶学性质及结构研究 | 第177-178页 |
| ·甘油脱水酶高通量筛选体系 | 第178页 |
| ·甘油脱水酶的非理性设计 | 第178-179页 |
| ·甘油脱水酶的理性设计 | 第179-180页 |
| ·问题与展望 | 第180-182页 |
| 参考文献 | 第182-195页 |
| 附录1 | 第195-203页 |
| 附录2 | 第203-206页 |
| 致谢 | 第206-208页 |
