| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第1章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 丝状真菌木质纤维素降解酶系 | 第13-16页 |
| 1.1.1 丝状真菌木质纤维素酶系的组成 | 第13-14页 |
| 1.1.2 丝状真菌半纤维素酶系的组成 | 第14页 |
| 1.1.3 丝状真菌木质纤维素酶系的协同作用与合成调控 | 第14-15页 |
| 1.1.4 丝状真菌木质纤维素酶的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2 β-葡萄糖苷酶 | 第16-18页 |
| 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质 | 第16页 |
| 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的催化机理 | 第16-17页 |
| 1.2.3 β-葡萄糖苷酶在工业中的应用 | 第17页 |
| 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.3 Red/ET重组技术 | 第18-20页 |
| 1.3.1 Red/ET系统简介 | 第18页 |
| 1.3.2 Red/ET重组技术的应用 | 第18-20页 |
| 1.4 β-rec/six自删除系统 | 第20页 |
| 1.4.1 β-rec/six自删除系统的原理 | 第20页 |
| 1.4.2 β-rec/six自删除系统在丝状真菌中的研究现状 | 第20页 |
| 1.5 CRISPR-Cas9 基因编辑技术 | 第20-23页 |
| 1.5.1 CRISPR-Cas9 系统的组成及作用原理 | 第21-22页 |
| 1.5.2 CRISPR-Cas9 技术的基因编辑机制 | 第22页 |
| 1.5.3 CRISPR-Cas9 技术的脱靶效应 | 第22页 |
| 1.5.4 CRISPR-Cas9 技术的操作步骤 | 第22页 |
| 1.5.5 CRISPR-Cas9 技术在丝状真菌中的应用 | 第22-23页 |
| 1.6 本论文的立题依据和研究意义 | 第23-25页 |
| 第2章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达 | 第25-49页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第25-26页 |
| 2.1.2 培养基 | 第26页 |
| 2.1.3 常用溶液配制 | 第26-27页 |
| 2.1.4 主要生化试剂和实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-40页 |
| 2.2.1 构建bgl1 过表达盒 | 第28-30页 |
| 2.2.2 利用Red/ET重组技术构建质粒 | 第30-31页 |
| 2.2.3 原生质体的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.4 原生质体转化 | 第32页 |
| 2.2.5 转化子的分离纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.6 基因组DNA的小量提取 | 第33页 |
| 2.2.7 转化子的PCR验证 | 第33-34页 |
| 2.2.8 胞外酶活力测定 | 第34-35页 |
| 2.2.9 过表达菌株表型分析 | 第35页 |
| 2.2.10 胞外蛋白浓度测定和蛋白电泳分析 | 第35页 |
| 2.2.11 Southern杂交 | 第35-37页 |
| 2.2.12 荧光定量PCR | 第37-40页 |
| 2.3 结果与分析 | 第40-46页 |
| 2.3.1 bgl1 过表达盒的构建 | 第40-42页 |
| 2.3.2 过表达bgl1 转化子的分离与验证 | 第42-43页 |
| 2.3.3 过表达转化子的酶活测定 | 第43-44页 |
| 2.3.4 过表达转化子的表型分析 | 第44页 |
| 2.3.5 过表达转化子胞外蛋白浓度测定和蛋白电泳分析 | 第44-45页 |
| 2.3.6 Southern杂交分析 | 第45-46页 |
| 2.3.7 荧光定量PCR分析 | 第46页 |
| 2.4 本章小结 | 第46-49页 |
| 第3章 优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株 | 第49-55页 |
| 3.1 材料和方法 | 第49-50页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第49页 |
| 3.1.2 培养基 | 第49-50页 |
| 3.1.3 主要溶液配制 | 第50页 |
| 3.1.4 主要生化试剂 | 第50页 |
| 3.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 3.2.1 基于β-rec/six重组技术构建bgl1 过表达盒 | 第50页 |
| 3.2.2 bgl1-β-rec/six过表达盒在草酸青霉中的表达 | 第50-51页 |
| 3.2.3 bgl1-β-rec/six过表达菌株筛选标记的去除及反选 | 第51页 |
| 3.2.4 过表达转化子的酶活测定 | 第51页 |
| 3.3 结果与分析 | 第51-54页 |
| 3.3.1 基于β-rec/six重组技术bgl1 过表达盒的构建 | 第51-52页 |
| 3.3.2 bgl1-β-rec/six转化子的分离与验证 | 第52页 |
| 3.3.3 去除筛选标记菌株的分离与验证 | 第52-54页 |
| 3.3.4 剪切前后菌株的酶活测定 | 第54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第4章 CRISPR-Cas9 系统在草酸青霉中的应用 | 第55-65页 |
| 4.1 材料和方法 | 第55-56页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第55页 |
| 4.1.2 培养基 | 第55页 |
| 4.1.3 主要溶液配制 | 第55页 |
| 4.1.4 主要生化试剂与实验仪器 | 第55-56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-61页 |
| 4.2.1 携带Cas9 蛋白基因的质粒说明 | 第56-57页 |
| 4.2.2 Cas9 蛋白在草酸青霉中的表达 | 第57-58页 |
| 4.2.3 构建sgRNA表达盒 | 第58-60页 |
| 4.2.4 Cas9 蛋白与sgRNA的共表达 | 第60-61页 |
| 4.3 结果与分析 | 第61-64页 |
| 4.3.1 质粒的线性化 | 第61页 |
| 4.3.2 sgRNA表达盒的构建 | 第61-62页 |
| 4.3.3 Cas9 蛋白基因转化子的分离与验证 | 第62-63页 |
| 4.3.4 质粒PFC332 转化子打靶结果验证 | 第63页 |
| 4.3.5 质粒pDHtsk–PE转化子的荧光检测 | 第63-64页 |
| 4.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 第5章 全文总结与展望 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 在学期间主要科研成果 | 第77页 |
