| 摘要 | 第11-12页 |
| 第一篇 文献综述 | 第12-18页 |
| 引言 | 第12页 |
| 1 微小隐孢子虫生活史 | 第12-13页 |
| 2 微小隐孢子虫入侵宿主细胞机制 | 第13-14页 |
| 3 微小隐孢子虫入侵宿主细胞相关粘附蛋白研究 | 第14-18页 |
| 3.1 gp40、gp15蛋白 | 第14-15页 |
| 3.2 CP23蛋白 | 第15-16页 |
| 3.3 GP900蛋白 | 第16-17页 |
| 3.4 CP12和CP21蛋白 | 第17页 |
| 3.5 其他相关蛋白 | 第17-18页 |
| 第二篇 研究内容 | 第18-52页 |
| 第一章 微小隐孢子虫gp60基因的克隆与表达 | 第18-37页 |
| 引言 | 第18页 |
| 1 材料与方法 | 第18-31页 |
| 1.1 材料 | 第18-20页 |
| 1.1.1 菌株、载体和虫株 | 第18页 |
| 1.1.2 分子生物学试剂和试剂盒 | 第18页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第18-19页 |
| 1.1.4 培养基 | 第19页 |
| 1.1.5 琼脂糖凝胶电泳所需材料 | 第19页 |
| 1.1.6 SDS-PAGE所需材料 | 第19-20页 |
| 1.1.7 免疫印迹分析所需材料 | 第20页 |
| 1.1.8 融合蛋白纯化所需材料 | 第20页 |
| 1.2 方法 | 第20-31页 |
| 1.2.1 卵囊DNA的提取 | 第20-21页 |
| 1.2.2 引物设计与合成 | 第21-22页 |
| 1.2.3 PCR扩增gp60序列 | 第22页 |
| 1.2.4 gp60PCR产物的纯化 | 第22页 |
| 1.2.5 gp60与载体pMD18-Teasy的连接 | 第22-23页 |
| 1.2.6 连接产物转化E.coli DH5α | 第23页 |
| 1.2.7 转化克隆及PCR鉴定 | 第23-24页 |
| 1.2.8 克隆载体的构建 | 第24-28页 |
| 1.2.8.1 gp60、gp40、gp15PCR产物纯化 | 第24页 |
| 1.2.8.2 gp60e、gp40e、gp15e与载体pMD18-Teasy的连接 | 第24-25页 |
| 1.2.8.3 连接产物转化E.coliDH5α | 第25页 |
| 1.2.8.4 转化克隆及PCR鉴定 | 第25页 |
| 1.2.8.5 质粒提取 | 第25-26页 |
| 1.2.8.6 pGEX-4-T-1载体的制备 | 第26-27页 |
| 1.2.8.7 酶切产物与表达载体的连接 | 第27页 |
| 1.2.8.8 连接产物转化E.coliRosetta | 第27页 |
| 1.2.8.9 PCR鉴定转化克隆 | 第27页 |
| 1.2.8.10 PCR阳性克隆的酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 1.2.9 gp60、gp40、gp15在E.coliRosetta的诱导表达 | 第28页 |
| 1.2.10 表达产物的处理 | 第28页 |
| 1.2.11 可溶蛋白的纯化及鉴定 | 第28-30页 |
| 1.2.11.1 可溶性蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| 1.2.11.2 可溶性纯化蛋白的鉴定 | 第29-30页 |
| 1.2.12 纯化蛋白浓度的检测 | 第30-31页 |
| 2 结果与分析 | 第31-35页 |
| 2.1 PCR扩增gp60序列 | 第31页 |
| 2.2 转化菌落的PCR鉴定 | 第31页 |
| 2.3 重组克隆质粒的鉴定 | 第31-32页 |
| 2.4 重组表达质粒的鉴定 | 第32-33页 |
| 2.5 重组蛋白的表达与纯化 | 第33-35页 |
| 2.6 Western blot鉴定重组蛋白 | 第35页 |
| 3 结论与讨论 | 第35-36页 |
| 3.1 蛋白表达系统分析 | 第35页 |
| 3.2 蛋白纯化分析 | 第35-36页 |
| 4 小结 | 第36-37页 |
| 第二章 重组蛋白Cpgp60、Cpgp40的亚细胞定位 | 第37-46页 |
| 引言 | 第37页 |
| 1 材料与方法 | 第37-40页 |
| 1.1 材料 | 第37-38页 |
| 1.1.1 实验动物 | 第37页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第37页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第37页 |
| 1.1.4 主要试剂及配制 | 第37-38页 |
| 1.2 方法 | 第38-40页 |
| 1.2.1 多克隆抗体的制备 | 第38-39页 |
| 1.2.1.1 动物免疫 | 第38页 |
| 1.2.1.2 血清的分离 | 第38页 |
| 1.2.1.3 抗血清的ELISA检测 | 第38-39页 |
| 1.2.1.4 亲和层析法纯化IgG | 第39页 |
| 1.2.2 亚细胞定位 | 第39-40页 |
| 2 结果与分析 | 第40-44页 |
| 2.1 抗血清效价的检测 | 第40页 |
| 2.2 多克隆抗体的纯化 | 第40-41页 |
| 2.3 亚细胞定位结果 | 第41-44页 |
| 3 结论与讨论 | 第44-45页 |
| 3.1 动物免疫血清的制备 | 第44页 |
| 3.2 多克隆抗体纯化 | 第44-45页 |
| 4 小结 | 第45-46页 |
| 第三章 Cpgp60、gp40蛋白相关生物学功能研究 | 第46-52页 |
| 引言 | 第46页 |
| 1 材料与方法 | 第46-48页 |
| 1.1 材料 | 第46页 |
| 1.1.1 主要仪器 | 第46页 |
| 1.1.2 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第46页 |
| 1.2 方法 | 第46-48页 |
| 1.2.1 RT-PCR检测gp60、gp40蛋白在不同时间点的表达量 | 第46-48页 |
| 1.2.1.1 细胞铺板 | 第46页 |
| 1.2.1.2 总RNA的提取 | 第46-47页 |
| 1.2.1.3 cDNA的合成 | 第47页 |
| 1.2.1.4 Real-timePCR检测表达量 | 第47-48页 |
| 1.2.2 不同抗体浓度阻断对微小隐孢子虫入侵宿主细胞的影响 | 第48页 |
| 1.2.2.1 细胞铺板 | 第48页 |
| 1.2.2.2 总RNA的提取 | 第48页 |
| 1.2.2.3 Real-time检测入侵率 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-49页 |
| 2.1 gp60和gp40蛋白在不同时间点的表达量 | 第48-49页 |
| 2.2 不同阻断抗体浓度微小隐孢子虫的入侵率 | 第49页 |
| 3 结论与讨论 | 第49-51页 |
| 3.1 隐孢子虫培养细胞系的选择 | 第49-50页 |
| 3.2 gp60与gp40蛋白在不同时间点表达量变化与虫体发育之间的关系 | 第50页 |
| 3.3 抗体阻断对微小隐孢子虫入侵宿主细胞的影响 | 第50-51页 |
| 4 小结 | 第51-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 附录 | 第61-62页 |
