| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第1章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 海洋病毒的研究概况 | 第10-14页 |
| 1.1.1 病毒概况 | 第10-11页 |
| 1.1.2 海洋病毒研究进展 | 第11-12页 |
| 1.1.3 海洋噬菌体的生态功能 | 第12页 |
| 1.1.4 嗜热噬菌体研究进展 | 第12-13页 |
| 1.1.5 深海嗜热噬菌体Geobacillus virus E2研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2 核酸酶研究概况 | 第14-15页 |
| 1.2.1 核酸酶及其分类 | 第14-15页 |
| 1.2.2 核酸酶的生理功能 | 第15页 |
| 1.2.3 核酸酶的应用 | 第15页 |
| 1.3 HNH核酸内切酶的研究概况 | 第15-17页 |
| 1.3.1 HNH核酸内切酶的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3.2 HNH核酸内切酶的空间结构特点 | 第16页 |
| 1.3.3 HNH核酸内切酶研究方向 | 第16-17页 |
| 1.4 本论文的研究目的、意义及内容 | 第17-20页 |
| 1.4.1 研究目的及意义 | 第17页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第17页 |
| 1.4.3 研究路线图 | 第17-20页 |
| 第2章 GVE2 HNH核酸内切酶的基因克隆、诱导表达及纯化 | 第20-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 实验试剂及耗材 | 第20页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第20-22页 |
| 2.1.3 实验所用的酶类 | 第22页 |
| 2.1.4 实验所用的感受态细胞及载体 | 第22页 |
| 2.2 实验内容与方法 | 第22-30页 |
| 2.2.1 GVE2基因组DNA的获取 | 第22页 |
| 2.2.2 试剂配制 | 第22-23页 |
| 2.2.3 引物合成与稀释 | 第23页 |
| 2.2.4 GVE2 HNH核酸内切酶基因的扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.5 PCR产物检测 | 第24页 |
| 2.2.6 回收PCR产物 | 第24-25页 |
| 2.2.7 GVE2 HNH核酸内切酶的基因与载体连接 | 第25-26页 |
| 2.2.8 重组质粒转化 | 第26-27页 |
| 2.2.9 阳性克隆的筛选 | 第27页 |
| 2.2.10 GVE2 HNH核酸内切酶的表达 | 第27-28页 |
| 2.2.11 GVE2 HNH核酸内切酶的纯化 | 第28-30页 |
| 2.2.12 GVE2 HNH核酸内切酶蛋白的质谱分析 | 第30页 |
| 2.3 实验结果 | 第30-34页 |
| 2.3.1 GVE2 HNH核酸内切酶基因的PCR结果 | 第30-31页 |
| 2.3.2 酚-氯仿法验证阳性克隆的结果 | 第31页 |
| 2.3.3 GVE2 HNH核酸内切酶可溶性表达的验证 | 第31-32页 |
| 2.3.4 GVE2 HNH核酸内切酶纯化结果 | 第32-33页 |
| 2.3.5 GVE2 HNH核酸内切酶的质谱分析 | 第33-34页 |
| 2.4 本章总结与讨论 | 第34-36页 |
| 第3章 GVE2 HNH核酸内切酶生化性质的研究 | 第36-44页 |
| 3.1 实验材料 | 第36页 |
| 3.2 实验内容与方法 | 第36-38页 |
| 3.2.1 GVE2 HNH核酸内切酶切割不同底物活性的分析 | 第36-37页 |
| 3.2.2 温度对GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的影响 | 第37页 |
| 3.2.3 GVE2 HNH核酸内切酶的热稳定性分析 | 第37页 |
| 3.2.4 pH对GVE2 HNH核酸内切酶活性的影响 | 第37页 |
| 3.2.5 二价金属离子对GVE2 HNH核酸内切酶活性的影响 | 第37-38页 |
| 3.2.6 GVE2 HNH核酸内切酶对盐浓度耐受性的分析 | 第38页 |
| 3.3 实验结果 | 第38-43页 |
| 3.3.1 GVE2 HNH核酸内切酶能够切割线性和闭合环状DNA | 第38-39页 |
| 3.3.2 GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的最适温度 | 第39-40页 |
| 3.3.3 GVE2 HNH核酸内切酶为热稳定性的核酸内切酶 | 第40-41页 |
| 3.3.4 GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的最适pH | 第41页 |
| 3.3.5 GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的最适金属离子 | 第41-42页 |
| 3.3.6 NaCl抑制GVE2 HNH核酸内切酶切割活性 | 第42-43页 |
| 3.4 总结与讨论 | 第43-44页 |
| 第4章 GVE2 HNH核酸内切酶晶体结构与催化机理的研究 (与中国科学院高能物理研究所合作完成) | 第44-60页 |
| 4.1 实验材料 | 第44页 |
| 4.2 实验内容与方法 | 第44-48页 |
| 4.2.1 GVE2 HNH核酸内切酶及其与金属离子形成复合物的晶体结构解析 | 第44-46页 |
| 4.2.2 GVE2 HNH核酸内切酶H93A、N109A和H118A突变体的构建 | 第46-47页 |
| 4.2.3 GVE2 HNH核酸内切酶突变体的表达纯化 | 第47页 |
| 4.2.4 野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶二级结构的分析 | 第47页 |
| 4.2.5 野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶的耐热性分析 | 第47页 |
| 4.2.6 GVE2 HNH核酸内切酶突变体切割活性的分析 | 第47-48页 |
| 4.2.7 Mn~(2+)对野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的影响 | 第48页 |
| 4.2.8 Zn~(2+)对野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶切割活性的影响 | 第48页 |
| 4.2.9 GVE2 HNH核酸内切酶结合Mn~(2+)或Zn~(2+)的分析 | 第48页 |
| 4.3 实验结果 | 第48-58页 |
| 4.3.1 GVE2 HNH核酸内切酶晶体结构的特征 | 第48-49页 |
| 4.3.2 GVE2 HNH核酸内切酶与其他HNH核酸内切酶的同源性比对 | 第49-50页 |
| 4.3.3 GVE2 HNH核酸内切酶锌指结构域的结构 | 第50-51页 |
| 4.3.4 GVE2 HNH核酸内切酶分别与Mn~(2+)或Zn~(2+)形成复合物的晶体结构 | 第51-52页 |
| 4.3.5 GVE2 HNH核酸内切酶突变体H93A、N108A和H118A的纯化 | 第52页 |
| 4.3.6 GVE2 HNH核酸内切酶及突变体二级结构的结果 | 第52-53页 |
| 4.3.7 GVE2 HNH核酸内切酶及突变体的热稳定性分析 | 第53-54页 |
| 4.3.8 GVE2 HNH核酸内切酶突变体切割活性的分析 | 第54-55页 |
| 4.3.9 Mn~(2+)对GVE2 HNH核酸内切酶及突变体活性的影响结果 | 第55-56页 |
| 4.3.10 Zn~(2+)对GVE2 HNH核酸内切酶及其突变体活性的影响结果 | 第56-57页 |
| 4.3.11 GVE2 HNH核酸内切酶结合Mn~(2+)和Zn~(2+)的分析结果 | 第57-58页 |
| 4.4 总结与讨论 | 第58-60页 |
| 第5章 总结与展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 致谢 | 第70-72页 |
| 攻读硕士期间论著发表及专利申请情况 | 第72-74页 |
