| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第14-29页 |
| 1.1 角蛋白的研究进展 | 第14-18页 |
| 1.1.1 角蛋白 | 第14-15页 |
| 1.1.2 角蛋白的结构 | 第15-16页 |
| 1.1.3 角蛋白的降解方法 | 第16-18页 |
| 1.2 角蛋白的应用 | 第18页 |
| 1.2.1 动物饲料 | 第18页 |
| 1.2.2 角蛋白的改性在材料中的应用 | 第18页 |
| 1.2.3 整形美容 | 第18页 |
| 1.3 角蛋白酶的研究进展 | 第18-25页 |
| 1.3.1 角蛋白酶 | 第18-19页 |
| 1.3.2 角蛋白酶的来源 | 第19-20页 |
| 1.3.3 角蛋白酶的分类 | 第20-21页 |
| 1.3.4 角蛋白酶的理化性质 | 第21-23页 |
| 1.3.5 角蛋白酶的降解机制 | 第23-24页 |
| 1.3.6 角蛋白酶的分子生物学研究 | 第24-25页 |
| 1.4 角蛋白酶的应用 | 第25-26页 |
| 1.4.1 饲料业 | 第26页 |
| 1.4.2 医药和化妆品 | 第26页 |
| 1.4.3 皮革工业 | 第26页 |
| 1.4.4 环境方面 | 第26页 |
| 1.5 课题研究的目的意义、主要内容及实验技术路线 | 第26-29页 |
| 1.5.1 课题研究的目的意义 | 第26-27页 |
| 1.5.2 课题研究的主要内容 | 第27页 |
| 1.5.3 实验技术路线 | 第27-29页 |
| 第二章 羽毛角蛋白降解菌的发酵条件优化 | 第29-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-31页 |
| 2.1.1 供试菌株 | 第29页 |
| 2.1.2 培养基 | 第29-30页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第30页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-34页 |
| 2.2.1 Plackett-Burman实验设计 | 第31-32页 |
| 2.2.2 最陡爬坡实验 | 第32页 |
| 2.2.3 响应面实验 | 第32-33页 |
| 2.2.4 验证实验 | 第33页 |
| 2.2.5 角蛋白酶的酶活测定方法 | 第33-34页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第34-42页 |
| 2.3.1 Plackett-Burman实验 | 第34-35页 |
| 2.3.2 最陡爬坡实验 | 第35-36页 |
| 2.3.3 Box-Behnken实验设计 | 第36-42页 |
| 2.3.4 验证实验 | 第42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 角蛋白酶基因的克隆、表达和纯化 | 第43-68页 |
| 3.1 实验材料 | 第43-46页 |
| 3.1.1 供试菌株及载体 | 第43页 |
| 3.1.2 培养基 | 第43页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第43-44页 |
| 3.1.4 实验仪器 | 第44-45页 |
| 3.1.5 常用缓冲液 | 第45-46页 |
| 3.2 实验方法 | 第46-57页 |
| 3.2.1 基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 3.2.2 引物设计 | 第47-48页 |
| 3.2.3 角蛋白酶基因全长的克隆 | 第48页 |
| 3.2.4 PCR产物的纯化(胶回收) | 第48-49页 |
| 3.2.5 角蛋白酶全长基因的磷酸化 | 第49页 |
| 3.2.6 角蛋白酶全长基因与克隆载体的连接 | 第49-50页 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态(E.coli DH5α)细胞的制备 | 第50页 |
| 3.2.8 重组克隆质粒的转化 | 第50页 |
| 3.2.9 重组克隆质粒DNA的提取 | 第50-51页 |
| 3.2.10 重组克隆质粒的酶切验证 | 第51-52页 |
| 3.2.11 重组克隆质粒的测序 | 第52页 |
| 3.2.12 角蛋白酶基因的克隆 | 第52页 |
| 3.2.13 PCR产物的纯化(胶回收) | 第52页 |
| 3.2.14 角蛋白酶基因PCR产物和表达载体质粒的酶切 | 第52-53页 |
| 3.2.15 角蛋白酶基因和表达载体质粒双酶切产物的纯化 | 第53页 |
| 3.2.16 表达重组质粒的连接 | 第53页 |
| 3.2.17 大肠杆菌感受态(E.coli BL21)细胞的制备 | 第53页 |
| 3.2.18 重组表达质粒的转化 | 第53-54页 |
| 3.2.19 重组表达质粒DNA的提取 | 第54页 |
| 3.2.20 重组表达质粒的酶切验证 | 第54页 |
| 3.2.21 重组表达质粒的测序 | 第54页 |
| 3.2.22 重组表达质粒的诱导表达 | 第54页 |
| 3.2.23 IPTG浓度的优化 | 第54-55页 |
| 3.2.24 诱导时间的优化 | 第55页 |
| 3.2.25 重组角蛋白酶表达形式的确定 | 第55-56页 |
| 3.2.26 包涵体的纯化 | 第56页 |
| 3.2.27 包涵体的复性 | 第56-57页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第57-67页 |
| 3.3.1 GZD-23基因组DNA的提取 | 第57页 |
| 3.3.2 角蛋白酶基因全长的克隆 | 第57-58页 |
| 3.3.3 重组克隆质粒DNA的提取及酶切验证 | 第58-59页 |
| 3.3.4 重组克隆质粒的测序与分析 | 第59页 |
| 3.3.5 角蛋白酶基因Ker的生物信息学分析 | 第59-60页 |
| 3.3.6 角蛋白酶基因的扩增 | 第60-61页 |
| 3.3.7 重组表达质粒DNA的鉴定及酶切验证 | 第61-62页 |
| 3.3.8 重组表达质粒的测序与分析 | 第62页 |
| 3.3.9 重组表达质粒的诱导表达 | 第62-63页 |
| 3.3.10 IPTG浓度的优化 | 第63-64页 |
| 3.3.11 诱导时间的优化 | 第64页 |
| 3.3.12 重组角蛋白酶表达形式的确定 | 第64-65页 |
| 3.3.13 包涵体的纯化 | 第65-66页 |
| 3.3.14 包涵体的复性 | 第66-67页 |
| 3.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第四章 角蛋白酶的酶学特性和动力学特性研究 | 第68-83页 |
| 4.1 实验材料 | 第68-70页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第68-69页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第69-70页 |
| 4.2 实验方法 | 第70-71页 |
| 4.2.1 温度对角蛋白酶酶活的影响 | 第70页 |
| 4.2.2 角蛋白酶的热稳定性 | 第70页 |
| 4.2.3 pH对角蛋白酶酶活的影响 | 第70页 |
| 4.2.4 角蛋白酶的pH稳定性 | 第70页 |
| 4.2.5 金属离子对角蛋白酶酶活的影响 | 第70页 |
| 4.2.6 抑制剂PMSF、螯合剂EDTA对角蛋白酶酶活的影响 | 第70-71页 |
| 4.2.7 还原剂和表面活性剂对角蛋白酶酶活的影响 | 第71页 |
| 4.2.8 有机溶剂对角蛋白酶酶活的影响 | 第71页 |
| 4.2.9 反应初速度的确定 | 第71页 |
| 4.2.10 Km值与最大反应速度的确定 | 第71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-82页 |
| 4.3.1 温度对角蛋白酶酶活的影响 | 第71-72页 |
| 4.3.2 角蛋白酶的热稳定性 | 第72-73页 |
| 4.3.3 pH对角蛋白酶酶活的影响 | 第73-74页 |
| 4.3.4 角蛋白酶的pH稳定性 | 第74-75页 |
| 4.3.5 金属离子对角蛋白酶酶活的影响 | 第75-76页 |
| 4.3.6 抑制剂PMSF、螯合剂EDTA对角蛋白酶酶活的影响 | 第76-77页 |
| 4.3.7 还原剂和表面活性剂对角蛋白酶酶活的影响 | 第77-79页 |
| 4.3.8 有机溶剂对角蛋白酶酶活的影响 | 第79-80页 |
| 4.3.9 反应初速度的确定 | 第80页 |
| 4.3.10 Km值与最大反应速度的确定 | 第80-82页 |
| 4.4 本章小结 | 第82-83页 |
| 第五章 总结与展望 | 第83-86页 |
| 5.1 结论 | 第83-84页 |
| 5.2 创新点 | 第84页 |
| 5.3 研究展望 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第92页 |
