| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第9-20页 |
| 1.1 克雷伯氏肺炎杆菌 | 第9-10页 |
| 1.1.1 CPS与LPS | 第9页 |
| 1.1.2 Klebsiella pneumoniae的荚膜多糖合成基因 | 第9-10页 |
| 1.2 同源重组技术 | 第10-16页 |
| 1.2.1 RecA蛋白与RecBCD蛋白 | 第10页 |
| 1.2.2 自杀质粒 | 第10-11页 |
| 1.2.3 Red重组酶 | 第11-12页 |
| 1.2.4 Cre/Flp重组酶 | 第12-13页 |
| 1.2.5 用于E.coli K12的Red重组质粒体系 | 第13-16页 |
| 1.3 遗传改造Klebsiella pneumoniae的研究进展 | 第16页 |
| 1.4 新一代测序技术 | 第16-18页 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 | 第18-20页 |
| 第2章 材料与方法 | 第20-30页 |
| 2.1 材料 | 第20-24页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 引物 | 第20-21页 |
| 2.1.3 限制性内切酶,Marker等分子生物学试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要化学试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.5 培养基配方 | 第23页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第23页 |
| 2.1.7 应用软件及程序 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-30页 |
| 2.2.1 微生物培养 | 第24页 |
| 2.2.2 菌种保藏 | 第24页 |
| 2.2.3 K.pneumoniae基因组的抽提 | 第24-25页 |
| 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第25页 |
| 2.2.5 PCR扩增目的片段 | 第25-26页 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化与回收 | 第26页 |
| 2.2.7 质粒抽提 | 第26-27页 |
| 2.2.8 DNA的酶切 | 第27页 |
| 2.2.9 DNA的连接 | 第27页 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.11 热激法转化连接产物 | 第28页 |
| 2.2.12 K.pneumoniae感受态的制备 | 第28页 |
| 2.2.13 K.pneumoniae电转化操作 | 第28-29页 |
| 2.2.14 电转杯的处理 | 第29页 |
| 2.2.15 阳性克隆的筛选 | 第29-30页 |
| 第3章 结果与讨论 | 第30-53页 |
| 3.1 确定要敲除的荚膜基因 | 第30-35页 |
| 3.1.1 K.pneumoniae基因组抽提 | 第30页 |
| 3.1.2 PCR扩增基因magA,wzi,WZC | 第30-32页 |
| 3.1.3 wzi-pMD18T与wzc-pMD1 8T的构建 | 第32-33页 |
| 3.1.4 阳性克隆的测序及分析 | 第33-35页 |
| 3.2 K.pneumoniae基因组测序结果的初步分析 | 第35-37页 |
| 3.2.1 确定合适的hash值 | 第35页 |
| 3.2.2 初步拼接得到片段与wzi片段的测序序列比对 | 第35-37页 |
| 3.3 利用K.pneumoniae自身的重组酶敲除基因wzi | 第37-43页 |
| 3.3.1 构建同源重组片段的流程 | 第37-39页 |
| 3.3.2 重组质粒wzi-pMD18T及FT-pMD18T的构建 | 第39-40页 |
| 3.3.3 重组质粒(△wzi::FT)-pMD18T的构建 | 第40-42页 |
| 3.3.4 电转条件的确定 | 第42页 |
| 3.3.5 基因敲除结果 | 第42-43页 |
| 3.4 利用λRed重组系统敲除基因wzi | 第43-53页 |
| 3.4.1 重组质粒pKD46-Tc与pCP20-Tc的构建 | 第43-46页 |
| 3.4.2 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的筛选 | 第46-47页 |
| 3.4.3.. 步PCR法扩增片段△wzi::FK | 第47-50页 |
| 3.4.4 重组质粒(△wzi::FK)-pMD18T的构建 | 第50-51页 |
| 3.4.5 基因敲除结果 | 第51-53页 |
| 第4章 结论与展望 | 第53-55页 |
| 4.1 结论 | 第53页 |
| 4.2 展望 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
