| 本论文的创新性工作 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| 英文摘要 | 第12-15页 |
| 缩略词表 | 第15-18页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的和意义 | 第18-25页 |
| 第一章 鸭瘟病毒和疱疹病毒UL46基因及其编码蛋白的研究进展 | 第18-25页 |
| 1 鸭瘟概述 | 第18页 |
| 2 鸭瘟病毒概述 | 第18-19页 |
| ·鸭瘟病毒的分类 | 第18页 |
| ·鸭瘟病毒的形态特征及形态发生 | 第18页 |
| ·鸭瘟病毒基因组研究概述 | 第18-19页 |
| 3 疱疹病毒UL46基因及其编码蛋白VP11/12的研究进展 | 第19-24页 |
| ·疱疹病毒概述 | 第19页 |
| ·疱疹病毒基因组结构 | 第19页 |
| ·疱疹病毒形态结构 | 第19-20页 |
| ·疱疹病毒皮层的结构和组成 | 第20页 |
| ·疱疹病毒UL46基因序列的特点 | 第20-21页 |
| ·VP11/12的细胞定位 | 第21页 |
| ·VP11/12表达时相 | 第21页 |
| ·VP11/12的功能 | 第21-22页 |
| ·VP11/12的结构功能和调节功能 | 第21-22页 |
| ·UL46-UL49基因簇编码蛋白的功能 | 第22页 |
| ·VP11/12与某些酶和其他蛋白的相互作用 | 第22-23页 |
| ·US3蛋白激酶对于VP11/12表达稳定性的影响 | 第22页 |
| ·UL21对VP11/12组装的影响 | 第22-23页 |
| ·VP11/12与VP13/14之间的相互作用 | 第23页 |
| ·VP11/12与VP16之间的相互作用 | 第23页 |
| ·VP11/12和VP13/14对aTIF蛋白的调控作用 | 第23页 |
| ·展望 | 第23-24页 |
| 4 选题目的和意义 | 第24-25页 |
| 第二部分 试验研究 | 第25-84页 |
| 第二章 鸭瘟病毒UL46基因的分子特性分析 | 第25-41页 |
| 1 DPV与其他疱疹病毒的UL46基因序列 | 第25页 |
| 2 生物信息学分析工具 | 第25页 |
| 3 方法 | 第25-27页 |
| ·UL46基因的鉴定 | 第25页 |
| ·核酸斑点杂交试验验证DPV | 第25-26页 |
| ·UL46基因寡核苷酸探针的合成 | 第25-26页 |
| ·核酸斑点杂交检测 | 第26页 |
| ·核酸探针特异性检测 | 第26页 |
| ·DPV UL46基因的分子特性分析 | 第26-27页 |
| ·核酸序列生物信息学分析 | 第27页 |
| ·氨基酸序列生物信息学分析 | 第27页 |
| 4 结果 | 第27-37页 |
| ·基于UL46基因的DNA斑点杂交检测DPV | 第27页 |
| ·UL46基因的分子特性分析 | 第27-37页 |
| ·UL46基因的鉴定 | 第27-28页 |
| ·DPV UL46核酸序列分析 | 第28-30页 |
| ·UL46基因序列的基本特性 | 第28-30页 |
| ·DPV UL46氨基酸序列分析 | 第30-37页 |
| ·疏水性预测 | 第31页 |
| ·信号肽预测 | 第31-32页 |
| ·跨膜区预测 | 第32页 |
| ·二级结构、B细胞表位预测分析及主要抗原域的确定 | 第32-33页 |
| ·功能位点及功能域的分析 | 第33-37页 |
| ·同源性与系统进化分析 | 第37页 |
| 5 讨论 | 第37-41页 |
| ·基于UL46基因探讨DPV的系统进化 | 第37-38页 |
| ·UL46基因的分子特性分析 | 第38-39页 |
| ·UL46蛋白抗原表位的分析及截断表达的意义 | 第39-41页 |
| 第三章 鸭瘟病毒UL46基因主要抗原域蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及初步应用 | 第41-58页 |
| 1 材料及仪器设备 | 第41页 |
| 2 方法 | 第41-49页 |
| ·DPV基因组DNA提取 | 第41页 |
| ·PCR扩增DPV UL46和UL46M基因 | 第41-44页 |
| ·引物设计 | 第41-43页 |
| ·UL46和UL46M基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| ·UL46和UL46M基因的T-载体克隆与鉴定 | 第44-45页 |
| ·UL46和UL46M基因的T-载体克隆 | 第44页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第44-45页 |
| ·UL46和UL46M基因重组表达菌株的构建 | 第45-46页 |
| ·感受态细胞的制备及目的片段的回收 | 第45页 |
| ·感受态细胞DH5a和Rosetta的制备 | 第45页 |
| ·pMD18-T/UL46、pMD18-T/UL46M及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收 | 第45页 |
| ·酶切回收产物pET-32a(+)与UL46和UL46M片段的连接 | 第45页 |
| ·重组表达质粒转化感受态细胞DH5α | 第45-46页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第46页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化 | 第46-47页 |
| ·纯化重组蛋白 | 第47页 |
| ·表达蛋白的可溶性分析 | 第47页 |
| ·包涵体的洗涤及纯化 | 第47页 |
| ·兔高免血清的制备及效价测定 | 第47-48页 |
| ·兔抗DPV UL46M高免血清IgG的纯化及鉴定 | 第48页 |
| ·饱和硫酸铵粗提取兔抗DPV UL46M IgG | 第48页 |
| ·过柱纯化兔抗DPV UL46M IgG及其纯度测定 | 第48页 |
| ·Western blot检测 | 第48页 |
| ·Dot-ELISA检测 | 第48-49页 |
| 3 结果 | 第49-55页 |
| ·DPV UL46和UL46M基因的扩增、克隆与鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组表达质粒pET-32a(+)/UL46和pET-32a(+)/UL46M的构建及鉴定 | 第50页 |
| ·重组质粒的诱导表达及表达条件优化 | 第50-51页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第50页 |
| ·表达条件的优化 | 第50-51页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第51页 |
| ·兔抗DPV UL46M血清效价的检测及IgG的纯化 | 第51页 |
| ·Western blot检测 | 第51-54页 |
| ·Dot-ELISA检测 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| ·基于UL46基因保守区段的主要抗原域的选取 | 第55-56页 |
| ·表达载体、宿主菌的选择 | 第56页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第56-57页 |
| ·关于Dot-ELISA | 第57-58页 |
| 第四章 实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒感染宿主细胞UL46 mRNA的转录时相 | 第58-67页 |
| 1 材料 | 第58-59页 |
| ·毒株、细胞及质粒 | 第58页 |
| ·主要试剂 | 第58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58-59页 |
| ·引物设计和合成 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-62页 |
| ·荧光定量PCR cDNA模板的制备 | 第59-60页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的制备与病毒感染 | 第59页 |
| ·总RNA的提取 | 第59-60页 |
| ·提取RNA的完整性及纯度测定 | 第60页 |
| ·总RNA的逆转录 | 第60页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第60-62页 |
| ·β-actin基因和UL46基因引物的特异性检测 | 第60-61页 |
| ·制备标准模板 | 第61页 |
| ·实时荧光定量PCR标准曲线的制作 | 第61页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第61-62页 |
| ·实时荧光定量PCR数据分析方法 | 第62页 |
| 3 结果 | 第62-66页 |
| ·RNA完整性及纯度分析 | 第62页 |
| ·引物特异性验证 | 第62页 |
| ·标准模板的确立 | 第62页 |
| ·标准曲线的制作 | 第62-64页 |
| ·荧光定量PCR检测UL46基因转录时相 | 第64-66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| ·荧光定量PCR | 第66页 |
| ·UL46基因转录时相的研究 | 第66-67页 |
| 第五章 鸭瘟病毒UL46基因表达时相分析 | 第67-70页 |
| 1 材料 | 第67页 |
| ·细胞、毒株和抗体 | 第67页 |
| ·主要试剂及配制 | 第67页 |
| 2 方法 | 第67-68页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养、病毒感染及细胞收获 | 第67页 |
| ·细胞蛋白的提取 | 第67页 |
| ·Western blot分析 | 第67-68页 |
| 3 结果 | 第68页 |
| ·Western blot检测DPV UL46蛋白在宿主细胞中的表达时相 | 第68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| ·Western blot分析UL46蛋白的表达时相 | 第68-69页 |
| ·DPV UL46基因表达谱分析 | 第69-70页 |
| 第六章 鸭瘟病毒UL46基因产物属性分析 | 第70-74页 |
| 1 材料 | 第70页 |
| ·细胞、毒株和抗体 | 第70页 |
| ·主要仪器设备 | 第70页 |
| 2 方法 | 第70-71页 |
| ·病毒感染 | 第70页 |
| ·DPV的超速离心及结构蛋白的验证 | 第70-71页 |
| ·UL46蛋白属性分析 | 第71页 |
| 3 结果 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 第七章 兔抗DPV UL46M多克隆抗体介导的双抗体夹心ELISA方法的建立及应用 | 第74-84页 |
| 1 材料 | 第74-75页 |
| ·毒株/菌株 | 第74页 |
| ·试验动物及待检可疑样品 | 第74-75页 |
| ·其他 | 第75页 |
| ·主要仪器设备 | 第75页 |
| 2 方法 | 第75-77页 |
| ·组织样品的处理 | 第75页 |
| ·病毒感染 | 第75页 |
| ·纯化DPV的制备 | 第75页 |
| ·考马斯亮蓝法测定纯化DPV浓度 | 第75-76页 |
| ·兔抗DPV UL46M IgG和小鼠抗DPV IgG最适浓度确定 | 第76页 |
| ·酶标抗体最适浓度的确定 | 第76页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法的建立 | 第76-77页 |
| ·双抗体夹心ELISA阴阳性临界值的确定 | 第77页 |
| ·交叉试验 | 第77页 |
| ·特异性试验 | 第77页 |
| ·灵敏度试验 | 第77页 |
| ·基于兔抗DPV UL46M抗体的双抗体夹心ELISA方法与常规PCR法在应用上的比较 | 第77页 |
| ·应用建立的双抗体夹心ELISA方法检测待检可疑样品 | 第77页 |
| ·常规PCR法检测待检可疑样品 | 第77页 |
| 3 结果 | 第77-82页 |
| ·考马斯亮蓝法测定纯化DPV浓度 | 第78页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法的建立与条件优化结果 | 第78页 |
| ·酶标抗体最适浓度的确定 | 第78-79页 |
| ·双抗体夹心ELISA阴阳性临界值的确定 | 第79页 |
| ·交叉试验结果 | 第79-80页 |
| ·特异性试验结果 | 第80页 |
| ·灵敏度检测结果 | 第80-81页 |
| ·双抗体夹心ELISA方法与常规PCR法在应用上的比较 | 第81-82页 |
| ·应用建立的双抗体夹心ELISA方法检测可疑样品结果 | 第81页 |
| ·常规PCR法检测待检可疑样品结果 | 第81-82页 |
| 4 讨论 | 第82-84页 |
| ·关于DPV的检测 | 第82页 |
| ·关于ELISA的建立 | 第82-83页 |
| ·关于ELISA的操作要点 | 第83-84页 |
| 第三部分 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 作者简介 | 第93页 |
