| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 常用中英文缩略词表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-37页 |
| 1 引言 | 第17-18页 |
| 2 脂肪形成 | 第18-32页 |
| 2.1 脂肪组织的功能 | 第18-20页 |
| 2.2 脂肪细胞的来源 | 第20-21页 |
| 2.3 参与调控脂肪分化的主要转录因子 | 第21-32页 |
| 2.3.1 PPAR家族 | 第22-23页 |
| 2.3.2 C/EBPs家族 | 第23-25页 |
| 2.3.3 KLFs家族 | 第25-32页 |
| 3 肌内脂肪 | 第32-34页 |
| 3.1 肌内脂肪的主要功能 | 第32-33页 |
| 3.2 肌内脂肪的发育 | 第33-34页 |
| 4 Myostatin | 第34-36页 |
| 4.1 MSTN与肌生成 | 第34-35页 |
| 4.2 MSTN与脂肪生成 | 第35页 |
| 4.3 MSTN的其他功能 | 第35-36页 |
| 5 研究的目的与意义 | 第36-37页 |
| 第二章 MSTN对PPARγ和MyoD基因表达量的影响 | 第37-61页 |
| 1 前言 | 第37-38页 |
| 2 材料与方法 | 第38-51页 |
| 2.1 主要试剂和仪器 | 第38页 |
| 2.2 主要溶液的配制 | 第38-40页 |
| 2.3 ADSCs和MSCs的分离培养 | 第40页 |
| 2.3.1 组织取样 | 第40页 |
| 2.3.2 酶消化法分离细胞 | 第40页 |
| 2.3.3 组织块贴壁培养法分离细胞 | 第40页 |
| 2.4 细胞的常规培养 | 第40-41页 |
| 2.5 细胞的免疫化学染色 | 第41页 |
| 2.6 细胞的成脂诱导 | 第41页 |
| 2.7 油红O染色 | 第41-42页 |
| 2.8 DNA/RNA共提取 | 第42-43页 |
| 2.9 Q-PCR分析 | 第43-45页 |
| 2.9.1 cDNA第一条链合成 | 第43-44页 |
| 2.9.2 Q-PCR反应 | 第44-45页 |
| 2.10 DNA甲基化分析 | 第45-48页 |
| 2.10.1 重亚硫酸盐处理 | 第45-46页 |
| 2.10.2 CpG岛区域扩增及测序 | 第46-48页 |
| 2.11 Western blotting分析 | 第48-50页 |
| 2.11.1 总蛋白提取 | 第48-49页 |
| 2.11.2 SDS-PAGE电泳 | 第49页 |
| 2.11.3 转膜 | 第49-50页 |
| 2.11.4 抗体抗原免疫反应 | 第50页 |
| 2.12 主要数据库及分析软件 | 第50页 |
| 2.13 统计学分析 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-58页 |
| 3.1 猪ADSCs和MSCs的分离与鉴定 | 第51-54页 |
| 3.1.1 猪ADSCs的分离与鉴定 | 第51-52页 |
| 3.1.2 猪MSCs的分离与鉴定 | 第52-54页 |
| 3.2 PPARγ和MyoD在mRNA水平上的表达情况 | 第54-55页 |
| 3.3 PPARγ和MyoD在蛋白水平上的表达情况 | 第55-56页 |
| 3.4 PPARy和MyoD启动子区CpG岛甲基化分析 | 第56-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 5 小结 | 第60-61页 |
| 第三章 转录因子MyoD对PPARγ转录活性的影响 | 第61-87页 |
| 1 前言 | 第61页 |
| 2 材料与方法 | 第61-76页 |
| 2.1 细胞系、载体 | 第61-63页 |
| 2.2 主要试剂及试剂盒 | 第63页 |
| 2.3 试验方法 | 第63-75页 |
| 2.3.1 PPARγ基因5'端上游调控区域双荧光素酶缺失片段的构建 | 第63-67页 |
| 2.3.2 细胞培养、细胞转染和双荧光素酶活性检测 | 第67-68页 |
| 2.3.3 转录因子结合位点定点突变 | 第68-69页 |
| 2.3.4 质粒共转染 | 第69页 |
| 2.3.5 EMSA试验 | 第69-73页 |
| 2.3.6 ChIP试验 | 第73页 |
| 2.3.7 MyoD的超表达及RNA干涉 | 第73-74页 |
| 2.3.8 DNA/RNA/蛋白共提取 | 第74-75页 |
| 2.4 应用到的主要生物信息学网站及分析软件 | 第75-76页 |
| 2.5 统计学分析 | 第76页 |
| 3 结果与分析 | 第76-84页 |
| 3.1 ADSCs中超表达MyoD对PPARγ基因的表达量及细胞成脂分化的影响 | 第76-78页 |
| 3.2 MSCs中干涉MyoD对PPARγ基因的表达量及细胞成脂分化的影响 | 第78页 |
| 3.3 猪PPARγ启动子缺失片段构建及转录活性分析 | 第78-80页 |
| 3.4 转录因子MyoD对PPARγ转录活性的影响 | 第80-82页 |
| 3.5 体外、体内试验确定MyoD结合于PPARγ启动子区域 | 第82-84页 |
| 4 讨论 | 第84-85页 |
| 5 小结 | 第85-87页 |
| 第四章 MSTN处理猪ADSCs和MSCs后差异表达基因的筛选及功能分析 | 第87-114页 |
| 1 前言 | 第87-88页 |
| 2 材料与方法 | 第88-93页 |
| 2.1 分离猪ADSCs和MSCs | 第88页 |
| 2.2 测序样品收集 | 第88页 |
| 2.3 总RNA提取 | 第88-89页 |
| 2.4 mRNA纯化 | 第89页 |
| 2.5 cDNA文库构建和Illumina HiseqTM 2500平台的测序 | 第89-90页 |
| 2.6 差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)筛选 | 第90页 |
| 2.7 差异基因GO富集分析 | 第90页 |
| 2.8 差异基因Pathway富集分析 | 第90-91页 |
| 2.9 荧光定量PCR验证测序结果 | 第91-92页 |
| 2.10 WISP2和KLF6真核超表达载体的构建 | 第92-93页 |
| 2.11 细胞转染 | 第93页 |
| 2.12 RNA/蛋白共提取 | 第93页 |
| 2.13 油红O染色 | 第93页 |
| 3 结果与分析 | 第93-110页 |
| 3.1 Illumina HiSeqTM2500高通量测序及结果分析 | 第93-102页 |
| 3.1.1 测序文库的制备 | 第93-94页 |
| 3.1.2 测序与质量评估 | 第94-95页 |
| 3.1.3 样品相关性分析 | 第95-96页 |
| 3.1.4 差异表达基因筛选 | 第96-97页 |
| 3.1.5 Q-PCR验证测序结果 | 第97-99页 |
| 3.1.6 AM/AC和MM/MC之间差异表达基因GO富集分析 | 第99-100页 |
| 3.1.7 AM/AC和MM/MC之间差异表达基因Pathway富集分析 | 第100-102页 |
| 3.2 与脂肪生成有关的基因的功能分析 | 第102-110页 |
| 3.2.1 WISP2基因 | 第102-106页 |
| 3.2.2 KLF6基因 | 第106-110页 |
| 4 讨论 | 第110-113页 |
| 4.0 高通量测序及结果验证 | 第110-111页 |
| 4.1 差异表达基因的获得及分析 | 第111-112页 |
| 4.2 WISP2对细胞成脂分化的影响 | 第112页 |
| 4.3 KLF6对细胞成脂分化的影响 | 第112-113页 |
| 5 小结 | 第113-114页 |
| 主要创新点 | 第114页 |
| 下一步工作建议 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-131页 |
| 在读期间发表论文题录 | 第131-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
