| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第17-39页 |
| 1.1 引言 | 第17页 |
| 1.2 传统基因组改造方法 | 第17-20页 |
| 1.2.1 诱变育种 | 第17-18页 |
| 1.2.2 自适应实验室进化 | 第18-19页 |
| 1.2.3 基因组重排 | 第19-20页 |
| 1.3 基因组工程 | 第20页 |
| 1.4 全局转录因子定向进化技术 | 第20-26页 |
| 1.4.1 基因的转录 | 第21页 |
| 1.4.2 转录因子 | 第21-22页 |
| 1.4.3 全局转录因子CRP | 第22页 |
| 1.4.4 CRP的结构特征 | 第22-23页 |
| 1.4.5 CRP调控基因转录的步骤[54] | 第23-24页 |
| 1.4.6 CRP突变提高大肠杆菌表型的研究进展 | 第24页 |
| 1.4.7 突变CRP提高大肠杆菌对渗透压的耐受能力 | 第24页 |
| 1.4.8 突变CRP提高大肠杆菌对甲苯的耐受能力 | 第24页 |
| 1.4.9 突变CRP提高大肠杆菌的其他表型 | 第24-25页 |
| 1.4.10 当前运用突变CRP提高大肠杆菌表型这一策略存在的不足和展望 | 第25页 |
| 1.4.11 全局转录因子FNR | 第25-26页 |
| 1.4.12 FNR突变提高大肠杆菌表型的研究进展 | 第26页 |
| 1.5 基因组多位点同时进化技术 | 第26-35页 |
| 1.5.1 重组 | 第27页 |
| 1.5.2 基因组多位点同时进化技术 | 第27-28页 |
| 1.5.3 寡核苷酸设计 | 第28页 |
| 1.5.4 提高同源重组效率的措施 | 第28-29页 |
| 1.5.5 同源重组中的共筛选策略 | 第29-30页 |
| 1.5.6 基因组多位点同时进化技术中重组概率的理论计算 | 第30-33页 |
| 1.5.6.1 对基因组上一个位点的反复同源重组 | 第30-31页 |
| 1.5.6.2 对基因组多个位点的反复同源重组 | 第31-33页 |
| 1.5.7 基因组多位点同时进化技术的应用 | 第33-34页 |
| 1.5.8 基因组多位点同时进化技术的拓展应用 | 第34-35页 |
| 1.5.8.1 微阵列芯片-寡核苷酸介导的基因组多位点同时进化技术 | 第34页 |
| 1.5.8.2 用CRISPR优化基因组多位点同时进化技术 | 第34-35页 |
| 1.6 番茄红素 | 第35-37页 |
| 1.6.1 番茄红素简介 | 第35页 |
| 1.6.2 微生物生产番茄红素 | 第35-36页 |
| 1.6.3 大肠杆菌中合成番茄红素途径的代谢优化 | 第36-37页 |
| 1.7 本工作的研究思路及拟研究内容 | 第37-39页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第39-49页 |
| 2.1 菌种与质粒 | 第39-41页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第41-42页 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 | 第41页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.3 培养基和培养方法 | 第42-43页 |
| 2.3.1 培养基 | 第42-43页 |
| 2.3.1.1 LB培养基 | 第42页 |
| 2.3.1.2 SOC液体培养基 | 第42页 |
| 2.3.1.3 M9培养基 | 第42-43页 |
| 2.3.1.4 MBL培养基 | 第43页 |
| 2.3.2 培养方法 | 第43页 |
| 2.4 实验方法 | 第43-49页 |
| 2.4.1 分子克隆实验 | 第43页 |
| 2.4.2 质粒的提取 | 第43页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第43-44页 |
| 2.4.4 PCR产物纯化DNA | 第44页 |
| 2.4.5 胶回收纯化DNA | 第44页 |
| 2.4.6 细胞密度测定 | 第44页 |
| 2.4.7 化学转化感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 2.4.8 电转化感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 2.4.9 电转化感受态细胞的电转化 | 第45-46页 |
| 2.4.10 基因组多位点同时进化技术操作流程 | 第46-49页 |
| 第三章 进化大肠杆菌全局转录因子CRP提高菌株番茄红素的生产能力 | 第49-65页 |
| 3.1 前言 | 第49页 |
| 3.2 材料与方法 | 第49-56页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第49-50页 |
| 3.2.2 培养基和培养方法 | 第50页 |
| 3.2.2.1 培养基 | 第50页 |
| 3.2.2.2 培养方法 | 第50页 |
| 3.2.3 化学感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 3.2.4 crp基因的PCR扩增及双酶切 | 第50-52页 |
| 3.2.5 重组质粒pUC18-crp的构建 | 第52页 |
| 3.2.6 重组质粒pKSC-crp的构建 | 第52-53页 |
| 3.2.7 crp突变文库的构建 | 第53页 |
| 3.2.7.1 crp随机突变文库的构建 | 第53页 |
| 3.2.7.2 crp定点突变文库的构建 | 第53页 |
| 3.2.8 电转感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 3.2.9 电转感受态细胞的电转化 | 第53-54页 |
| 3.2.10 番茄红素的标准曲线的测定 | 第54页 |
| 3.2.11 大肠杆菌中番茄红素的提取与产量测定 | 第54页 |
| 3.2.12 crp突变子的筛选 | 第54-55页 |
| 3.2.13 含突变的crp基因重组到BW25113-BIE基因组 | 第55-56页 |
| 3.2.14 Fed-batch发酵 | 第55页 |
| 3.2.15 DNA芯片分析 | 第55-56页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第56-64页 |
| 3.3.1 重组质粒pUC18-crp的构建 | 第56页 |
| 3.3.2 重组质粒pKSC-crp的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.3 番茄红素的标准曲线 | 第57-58页 |
| 3.3.4 crp突变子的筛选 | 第58-59页 |
| 3.3.5 crp突变子的同源重组 | 第59-60页 |
| 3.3.6 罐上放大培养 | 第60-61页 |
| 3.3.7 MT-1菌株的基因转录分析 | 第61-63页 |
| 3.3.8 CRP的A26T(D8V)突变对其它类胡萝卜素产量的提高 | 第63-64页 |
| 3.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 第四章 进化大肠杆菌全局转录因子FNR提高菌体对乙醇和丁醇的耐受性 | 第65-81页 |
| 4.1 前言 | 第65页 |
| 4.2 材料与方法 | 第65-70页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第65-66页 |
| 4.2.2 培养基和培养方法 | 第66页 |
| 4.2.2.1 培养基 | 第66页 |
| 4.2.2.2 培养方法 | 第66页 |
| 4.2.3 化学感受态细胞的制备 | 第66页 |
| 4.2.4 FNR基因的PCR扩增及双酶切 | 第66-67页 |
| 4.2.5 重组质粒pUC18-fnr的构建 | 第67页 |
| 4.2.6 重组质粒pKSC-fnr的构建 | 第67-68页 |
| 4.2.7 电转感受态细胞的制备 | 第68页 |
| 4.2.8 电转感受态细胞的电转化 | 第68页 |
| 4.2.9 FNR随机突变文库的构建 | 第68页 |
| 4.2.10 FNR突变子的筛选 | 第68-69页 |
| 4.2.10.1 用乙醇作为压力 | 第68页 |
| 4.2.10.2 用丁醇作为压力 | 第68-69页 |
| 4.2.11 fnr突变子的效果验证 | 第69页 |
| 4.2.12 含突变的FNR基因重组到DH5α基因组 | 第69页 |
| 4.2.13 重组子对乙醇或丁醇耐受性的验证 | 第69-70页 |
| 4.2.13.1 生长曲线 | 第69页 |
| 4.2.13.2 存活率 | 第69-70页 |
| 4.2.14 对其它醇类耐受性的提高 | 第70页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第70-80页 |
| 4.3.1 重组质粒pUC18-fnr的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.2 重组质粒pKSC-fnr的构建 | 第71页 |
| 4.3.3 提高大肠杆菌乙醇耐受性的FNR突变子筛选 | 第71-72页 |
| 4.3.4 E1和E2在乙醇压力下的生长曲线 | 第72页 |
| 4.3.5 fnr突变子同源重组到DH5α基因组 | 第72-73页 |
| 4.3.6 iE1和iE2菌株在乙醇压力条件下的生长曲线 | 第73-74页 |
| 4.3.7 iE1和iE2菌株在高浓度乙醇下的存活率 | 第74-75页 |
| 4.3.8 iE1和iE2菌株对其它醇类耐受性的提高 | 第75-76页 |
| 4.3.9 提高大肠杆菌丁醇耐受性的FNR突变子筛选 | 第76-77页 |
| 4.3.10 B1和B2在丁醇压力下的生长曲线 | 第77-78页 |
| 4.3.11 fnr突变子同源重组到DH5α基因组 | 第78页 |
| 4.3.12 iB1和iB2菌株在丁醇压力条件下的生长曲线 | 第78-79页 |
| 4.3.13 iB1和iB2菌株在高浓度丁醇下的存活率 | 第79-80页 |
| 4.4 本章小结 | 第80-81页 |
| 第五章 大肠杆菌基因组原位进化仪的搭建 | 第81-95页 |
| 5.1 前言 | 第81页 |
| 5.2 材料与方法 | 第81-82页 |
| 5.2.1 本章所用到的部件 | 第81-82页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第82-94页 |
| 5.3.1 大肠杆菌基因组原位进化技术 | 第82-83页 |
| 5.3.2 大肠杆菌基因组原位进化技术的操作步骤 | 第83-84页 |
| 5.3.3 大肠杆菌基因组原位进化技术的自动化 | 第84-85页 |
| 5.3.4 自动化平台蓝图1.0 | 第85-86页 |
| 5.3.5 自动化平台蓝图2.0 | 第86-87页 |
| 5.3.6 自动化平台各部件的选型 | 第87-91页 |
| 5.3.6.1 平台结构设计 | 第87-88页 |
| 5.3.6.2 机械手的驱动单元选型 | 第88-89页 |
| 5.3.6.3 自动取样器的选型 | 第89页 |
| 5.3.6.4 恒温振荡器的选型 | 第89-90页 |
| 5.3.6.5 金属浴的选型 | 第90页 |
| 5.3.6.6 真空过滤装置的选型 | 第90页 |
| 5.3.6.7 电转化仪的选型 | 第90页 |
| 5.3.6.8 其它部件的选型 | 第90-91页 |
| 5.3.7 自动化平台的组装与控制 | 第91页 |
| 5.3.8 自动化平台原型机 | 第91-92页 |
| 5.3.9 自动化平台原型机的运作过程 | 第92-93页 |
| 5.3.10 自动化平台原型机的软件界面 | 第93-94页 |
| 5.4 本章小结 | 第94-95页 |
| 第六章 利用合成的寡核苷酸实现pqqgdh基因的原位进化 | 第95-109页 |
| 6.1 前言 | 第95-96页 |
| 6.2 材料与方法 | 第96-102页 |
| 6.2.1 菌株与质粒 | 第96页 |
| 6.2.2 培养基和培养方法 | 第96页 |
| 6.2.2.1 培养基 | 第96页 |
| 6.2.2.2 培养方法 | 第96页 |
| 6.2.3 E.coli EcGDH菌株的构建 | 第96-99页 |
| 6.2.3.1 E.coli EcNR2-△bla菌株的构建 | 第96-97页 |
| 6.2.3.2 pTrc99a-gdh-kan质粒的构建 | 第97-99页 |
| 6.2.3.3 Ptrc-SD-gdh-kan基因盒片段的同源重组 | 第99页 |
| 6.2.4 gdh基因的原位突变 | 第99-100页 |
| 6.2.5 基于颜色反应的突变筛选 | 第100页 |
| 6.2.5.1 基于颜色反应筛选热稳定性提高的PQQGDH蛋白 | 第100页 |
| 6.2.5.2 基于颜色反应筛选底物特异性提高的PQQGDH蛋白 | 第100页 |
| 6.2.5.3 突变菌株中gdh基因的突变位点 | 第100页 |
| 6.2.6 PQQGDH突变体的性质检测 | 第100-102页 |
| 6.2.6.1 PQQGDH突变体的表达纯化 | 第100-101页 |
| 6.2.6.2 PQQGDH蛋白体外热稳定性的测定 | 第101页 |
| 6.2.6.3 PQQGDH蛋白体外底物特异性的测定 | 第101-102页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第102-108页 |
| 6.3.1 E.coil EcGDH菌株的构建 | 第102-104页 |
| 6.3.1.1 E.coli EcNR2-△bla菌株的构建 | 第102-103页 |
| 6.3.1.2 gdh基因在基因组上的插入及PQQGDH酶活的检测 | 第103-104页 |
| 6.3.2 gdh基因的原位突变 | 第104页 |
| 6.3.3 基于颜色反应的突变筛选 | 第104-105页 |
| 6.3.3.1 热稳定性提高的突变株的筛选 | 第104-105页 |
| 6.3.3.2 底物特异性提高的突变株的筛选 | 第105页 |
| 6.3.4 PQQGDH突变体的突变位点 | 第105-106页 |
| 6.3.5 PQQGDH突变体的性质检测 | 第106-108页 |
| 6.3.5.1 PQQGDH突变体的热稳定性检测 | 第106-107页 |
| 6.3.5.2 PQQGDH突变体的底物特异性检测 | 第107-108页 |
| 6.4 本章小结 | 第108-109页 |
| 第七章 体外易错PCR制备双链DNA实现基因组上dxs基因的原位进化 | 第109-135页 |
| 7.1 前言 | 第109页 |
| 7.2 材料与方法 | 第109-116页 |
| 7.2.1 菌株与质粒 | 第109-110页 |
| 7.2.2 培养基和培养方法 | 第110页 |
| 7.2.2.1 培养基 | 第110页 |
| 7.2.2.2 培养方法 | 第110页 |
| 7.2.3 E.coli EcLYC菌株的构建 | 第110-113页 |
| 7.2.3.1 E.coli EcNR2-△bla-△chl菌株的构建 | 第110-111页 |
| 7.2.3.2 pTrc99a-crtEBI-kan质粒的构建 | 第111-112页 |
| 7.2.3.3 Ptrc-SD-crtEBI-kan基因盒片段的同源重组 | 第112-113页 |
| 7.2.4 双链DNA与同源重组效率的关系 | 第113页 |
| 7.2.4.1 双链DNA长度对同源重组效率的影响 | 第113页 |
| 7.2.4.2 共筛选对双链DNA同源重组效率的影响 | 第113页 |
| 7.2.5 dxs基因的体外易错PCR | 第113-114页 |
| 7.2.5.1 PCR模板质粒PMD18-dxs的构建 | 第113-114页 |
| 7.2.5.2 dxs基因体外易错PCR长度的选择 | 第114页 |
| 7.2.6 dxs基因的原位进化 | 第114页 |
| 7.2.7 基于颜色反应的突变筛选 | 第114页 |
| 7.2.8 dxs基因的突变位点和番茄红素产量测定 | 第114-115页 |
| 7.2.8.1 dxs基因的突变位点 | 第114-115页 |
| 7.2.8.2 dxs基因突变菌株的番茄红素产量测定 | 第115页 |
| 7.2.9 DXS突变体的体外酶活测定 | 第115-116页 |
| 7.2.9.1 DXS突变体的酶活表达纯化 | 第115页 |
| 7.2.9.2 HPLC法测定DXS的酶活 | 第115-116页 |
| 7.2.9.3 DXS的体外酶反应 | 第116页 |
| 7.2.10 dxs突变基因的重组 | 第116页 |
| 7.2.11 高产菌株E.coli EcHW2f的进化 | 第116页 |
| 7.3 结果与讨论 | 第116-133页 |
| 7.3.1 E.coli EcLYC菌株的构建 | 第116-118页 |
| 7.3.1.1 E.coli EcNR2-△bla-△chl菌株的构建 | 第116-117页 |
| 7.3.1.2 pTrc99a-crtEBI-kan质粒的构建 | 第117页 |
| 7.3.1.3 crtEBI-kan基因盒插入大肠杆菌基因组 | 第117-118页 |
| 7.3.2 双链DNA与同源重组效率的关系 | 第118-120页 |
| 7.3.2.1 双链DNA长度对同源重组效率的影响 | 第118-119页 |
| 7.3.2.2 共筛选对双链DNA同源重组效率的影响 | 第119-120页 |
| 7.3.3 dxs基因的体外易错PCR | 第120-121页 |
| 7.3.4 dxs突变菌株的获取 | 第121-123页 |
| 7.3.4.1 dxs突变基因的筛选 | 第121-122页 |
| 7.3.4.2 dxs基因突变位点的确认 | 第122页 |
| 7.3.4.3 突变菌株番茄红素产量的测定 | 第122-123页 |
| 7.3.5 突变菌株的深入分析 | 第123-125页 |
| 7.3.5.1 突变菌株的番茄红素产量 | 第124页 |
| 7.3.5.2 突变菌株的番茄红素产量与突变位点的关系 | 第124-125页 |
| 7.3.6 DXS突变蛋白的酶活测定 | 第125-129页 |
| 7.3.6.1 DXS突变蛋白的表达与纯化 | 第125-127页 |
| 7.3.6.2 HPLC测定DXS蛋白酶活方法的建立 | 第127-128页 |
| 7.3.6.3 DXS蛋白体外酶活的测定 | 第128-129页 |
| 7.3.7 各突变体和野生型DXS蛋白的总酶活与菌株番茄红素产量的关系 | 第129-130页 |
| 7.3.8 dxs突变基因插入E.coli EcLYC基因组 | 第130-131页 |
| 7.3.8.1 dxs突变基因的重组 | 第130-131页 |
| 7.3.8.2 新菌株的番茄红素产量测定 | 第131页 |
| 7.3.9 高产菌株E.coli EcHW2f的进化 | 第131-133页 |
| 7.4 本章小结 | 第133-135页 |
| 第八章 体外制备单链DNA用于大肠杆菌中蛋白质的体内进化 | 第135-153页 |
| 8.1 前言 | 第135页 |
| 8.2 材料与方法 | 第135-138页 |
| 8.2.1 菌株与质粒 | 第135-136页 |
| 8.2.2 培养基和培养方法 | 第136页 |
| 8.2.2.1 培养基 | 第136页 |
| 8.2.2.2 培养方法 | 第136页 |
| 8.2.3 本章所用引物的设计原则 | 第136页 |
| 8.2.4 两步PCR法制备单链DNA | 第136-137页 |
| 8.2.5 Lambda EXO外切酶处理两步PCR法得到的产物 | 第137页 |
| 8.2.6 异丙醇沉淀回收酶切产物 | 第137页 |
| 8.2.7 单链DNA的片段化 | 第137页 |
| 8.2.8 短链DNA的回收 | 第137-138页 |
| 8.2.9 蛋白质的原位进化 | 第138页 |
| 8.2.10 突变菌株的筛选 | 第138页 |
| 8.2.11 基因的突变位点和番茄红素产量测定 | 第138页 |
| 8.3 结果与讨论 | 第138-150页 |
| 8.3.1 制备单链DNA的PCR条件优化 | 第138-141页 |
| 8.3.1.1 PCR体系中dNTP浓度的优化 | 第138-139页 |
| 8.3.1.2 PCR体系中Mg~(2+)浓度的优化 | 第139-140页 |
| 8.3.1.3 PCR体系中模板浓度的优化 | 第140-141页 |
| 8.3.2 两步PCR法制备单链DNA | 第141-142页 |
| 8.3.3 Lambda EXO处理PCR产物及回收 | 第142-144页 |
| 8.3.4 利用单链DNA对dxs基因进行原位进化 | 第144-145页 |
| 8.3.4.1 单链DNA的制备 | 第144页 |
| 8.3.4.2 突变菌株的dxs基因突变位点 | 第144页 |
| 8.3.4.3 突变菌株的番茄红素产量 | 第144-145页 |
| 8.3.5 利用单链DNA对dxs和dxr基因进行原位进化 | 第145-146页 |
| 8.3.5.1 单链DNA的制备 | 第145-146页 |
| 8.3.5.2 突变菌株中基因的突变位点 | 第146页 |
| 8.3.6 90 bp单链DNA的制备 | 第146-148页 |
| 8.3.6.1 单链DNA的片段化 | 第146-147页 |
| 8.3.6.2 90 bp单链DNA的回收 | 第147-148页 |
| 8.3.7 利用90 bp单链DNA对dxs基因进行原位进化 | 第148-150页 |
| 8.3.7.1 dxs基因90 bp单链DNA的制备 | 第148页 |
| 8.3.7.2 dxs基因的原位进化 | 第148-149页 |
| 8.3.7.3 突变株的突变位点及番茄红素产量 | 第149-150页 |
| 8.4 本章小结 | 第150-153页 |
| 第九章 结论与展望 | 第153-156页 |
| 9.1 结论 | 第153-155页 |
| 9.2 展望 | 第155-156页 |
| 参考文献 | 第156-167页 |
| 附录 | 第167-179页 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 | 第179页 |
