| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 主要缩略词 | 第12-16页 |
| 1 引言 | 第16-40页 |
| 1.1 耐辐射奇球菌的介绍 | 第16-29页 |
| 1.1.1 耐辐射奇球菌的概况 | 第16-17页 |
| 1.1.2 耐辐射奇球菌的基因组分析 | 第17-18页 |
| 1.1.3 耐辐射奇球菌的极端抗性 | 第18-20页 |
| 1.1.4 耐辐射奇球菌的极端抗性机制 | 第20-24页 |
| 1.1.5 耐辐射奇球菌的DNA损伤修复机制 | 第24-28页 |
| 1.1.6 辐射/干燥响应基序(RDRM序列) | 第28-29页 |
| 1.1.7 耐辐射奇球菌的生物学应用 | 第29页 |
| 1.2 双组份信号转导系统与DrRRA的研究进展 | 第29-33页 |
| 1.2.1 双组份信号转导系统的简介 | 第29-30页 |
| 1.2.2 双组分系统的基本组成和作用机制 | 第30-31页 |
| 1.2.3 反应调节蛋白的多样性及功能 | 第31-32页 |
| 1.2.4 耐辐射奇球菌中反应调节蛋白DrRRA的研究进展 | 第32-33页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统的介绍 | 第33-40页 |
| 1.3.1 基因编辑技术简介 | 第33-34页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的发现 | 第34-35页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas系统的免疫机制 | 第35-36页 |
| 1.3.4 Ⅱ型CRISPR-Cas9系统 | 第36-38页 |
| 1.3.5 CRISPR-Cas9技术的应用 | 第38-40页 |
| 2 实验材料与方法 | 第40-57页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第40-41页 |
| 2.2 主要试剂与仪器 | 第41-43页 |
| 2.2.1 主要试剂盒 | 第41页 |
| 2.2.2 主要酶试剂 | 第41-42页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第42-43页 |
| 2.3 双向电泳实验方法 | 第43-46页 |
| 2.3.1 蛋白提取 | 第43页 |
| 2.3.2 蛋白定量 | 第43页 |
| 2.3.3 双向电泳 | 第43-44页 |
| 2.3.4 电泳凝胶染色 | 第44页 |
| 2.3.5 图象扫描和分析 | 第44-45页 |
| 2.3.6 差异蛋白质点的胶内酶解和鉴定 | 第45页 |
| 2.3.7 数据库检索 | 第45-46页 |
| 2.4 耐辐射奇球菌基因缺失突变株的构建及生存率的测定 | 第46-48页 |
| 2.4.1 耐辐射奇球菌基因缺失突变株的构建 | 第46页 |
| 2.4.2 生存率的测定 | 第46-48页 |
| 2.5 CRISPR-Cas9质粒构建方法 | 第48-50页 |
| 2.5.1 主要PCR引物列表 | 第48-49页 |
| 2.5.2 主要反应体系 | 第49-50页 |
| 2.6 主要实验方法 | 第50-57页 |
| 2.6.1 质粒提取步骤 | 第50-51页 |
| 2.6.2 基因组提取步骤 | 第51-52页 |
| 2.6.3 大肠杆菌质粒转化 | 第52页 |
| 2.6.4 点突变PCR及产物转化 | 第52-53页 |
| 2.6.5 耐辐射奇球菌的感受态制备及质粒/PCR产物等的转化 | 第53页 |
| 2.6.6 PCR产物纯化 | 第53-54页 |
| 2.6.7 胶回收步骤 | 第54页 |
| 2.6.8 RNA的提取 | 第54-56页 |
| 2.6.9 反转录体系 | 第56页 |
| 2.6.10 实时定量PCR反应 | 第56页 |
| 2.6.11 生长曲线的测定 | 第56-57页 |
| 3 实验结果分析 | 第57-76页 |
| 3.1 耐辐射奇球菌drRRA突变株的蛋白质组学电泳图谱 | 第57-58页 |
| 3.2 drRRA的缺失导致的蛋白质表达差异 | 第58-65页 |
| 3.3 表达差异基因的敲除导致耐辐射奇球菌对氧化压力敏感 | 第65-67页 |
| 3.4 耐辐射奇球菌中CRISPR-Cas9系统的构建 | 第67-71页 |
| 3.4.1 带绿色荧光蛋白eGFP的穿梭质粒PRADG的构建 | 第67页 |
| 3.4.2 融合绿色荧光蛋白标签的Cas9蛋白的表达质粒PRADG-Cas9的构建 | 第67-68页 |
| 3.4.3 PRAD-Cas9的构建 | 第68-69页 |
| 3.4.4 连有启动子的gRNA的设计 | 第69-70页 |
| 3.4.5 PRADG-CRISPR与PRAD-CRISPR质粒的构建 | 第70-71页 |
| 3.5 耐辐射奇球菌中CRISPRi系统的构建 | 第71页 |
| 3.6 CRISPR-Cas9系统的在耐辐射奇球菌体内表达验证 | 第71-73页 |
| 3.6.1 耐辐射奇球菌的质粒转化 | 第71页 |
| 3.6.2 生长曲线的测定 | 第71-72页 |
| 3.6.3 绿色荧光蛋白信号的检测 | 第72-73页 |
| 3.6.4 实时定量PCR反应 | 第73页 |
| 3.7 CRISPR系统所需进行的优化(今后的工作计划) | 第73-76页 |
| 3.7.1 gRNA中靶序列的改变 | 第73-74页 |
| 3.7.2 Cas9基因前启动子的改变 | 第74-75页 |
| 3.7.3 gRNA前启动子的改变 | 第75页 |
| 3.7.4 转化菌株的改变 | 第75-76页 |
| 4 讨论分析和展望 | 第76-81页 |
| 4.1 耐辐射奇球菌drRRA突变株的蛋白质组学分析 | 第76-78页 |
| 4.2 耐辐射奇球菌基于CRISPR技术的新型基因敲除系统的构建 | 第78-81页 |
| 参考文献 | 第81-95页 |
| 硕士期间发表论文 | 第95页 |
