| 第一章 前言 | 第11-60页 |
| 1 极端微生物简介 | 第11-13页 |
| 2 嗜热古细菌 | 第13-17页 |
| 3 嗜热酶的稳定性及其应用 | 第17-33页 |
| 3.1 嗜热酶简介 | 第17-18页 |
| 3.2 嗜热酶的稳定性机制 | 第18-30页 |
| 3.3 嗜热酶的应用 | 第30-33页 |
| 4 磷脂酶A_2(PLA_2)简介 | 第33-37页 |
| 4.1 PLA_2的分类 | 第34-35页 |
| 4.2 磷脂酶A_2的作用机制 | 第35-36页 |
| 4.3 磷脂酶A_2的应用前景 | 第36-37页 |
| 5 酯酶简介 | 第37-42页 |
| 5.1 酯酶及其分类 | 第37-39页 |
| 5.2 生物催化方面的应用 | 第39-41页 |
| 5.3 酯酶的定向进化 | 第41-42页 |
| 6 本论文的研究背景及立论依据 | 第42-47页 |
| 6.1 磷脂酶A_2的研究 | 第42-43页 |
| 6.2 嗜热酶稳定性的研究 | 第43-47页 |
| 7 参考文献 | 第47-60页 |
| 第二章 超嗜热酶APE 2325酶学性质的研究 | 第60-100页 |
| 第一节 APE 2325的序列分析和同源序列比较 | 第60-69页 |
| 1 引言 | 第60页 |
| 2 磷脂酶A_2的motif的搜索及同源序列比较 | 第60-63页 |
| 3 氨基酸组成分析 | 第63-65页 |
| 4 APE 2325的结构预测 | 第65-67页 |
| 5 小结 | 第67-68页 |
| 6 参考文献 | 第68-69页 |
| 第二节 APE 2325工程菌的构建及重组酶的分离纯化 | 第69-86页 |
| 1 引言 | 第69页 |
| 2 溶液配制 | 第69-71页 |
| 3 实验方法 | 第71-80页 |
| 3.1 古细菌Aeropyrum pcrnix K1的培养 | 第71页 |
| 3.2 基因组DNA的提取 | 第71-72页 |
| 3.3 基因的克隆与纯化 | 第72-74页 |
| 3.4 载体DNA的限制性酶切、纯化及去磷酸化处理 | 第74-75页 |
| 3.5 目的基因与载体的连接 | 第75页 |
| 3.6 感受态细胞的制备 | 第75页 |
| 3.7 重组质粒的转化 | 第75-76页 |
| 3.8 单克隆菌株的筛选和鉴定 | 第76-77页 |
| 3.9 目的基因的序列测定 | 第77页 |
| 3.10 APE 2325的分离纯化 | 第77-78页 |
| 3.11 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第78-79页 |
| 3.12 酶活力的测定 | 第79-80页 |
| 3.13 蛋白质浓度的测定 | 第80页 |
| 4 结果与讨论 | 第80-85页 |
| 4.1 古细菌的培养 | 第80页 |
| 4.2 重组质粒的构建 | 第80-82页 |
| 4.3 重组质粒的转化及鉴定 | 第82页 |
| 4.4 热变性 | 第82-83页 |
| 4.5 Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和柱层析 | 第83-85页 |
| 5 小结 | 第85页 |
| 6 参考文献 | 第85-86页 |
| 第三节 APE 2325的基本酶学性质的研究 | 第86-100页 |
| 1 引言 | 第86页 |
| 2 实验方法 | 第86-88页 |
| 2.1 如不特殊说明，活力测定方法同前 | 第86页 |
| 2.2 APE 2325最适温度的测定 | 第86页 |
| 2.3 APE 2325热稳定性 | 第86-87页 |
| 2.4 APE 2325 pH稳定性 | 第87页 |
| 2.5 APE 2325的酯酶底物特异性 | 第87页 |
| 2.6 APE 2325动力学常数的测定 | 第87页 |
| 2.7 金属离子及EDTA对APE 2325酯酶酶活力的影响 | 第87-88页 |
| 3 结果与讨论 | 第88-98页 |
| 3.1 APE 2325的磷脂酶A_2(PLA_2)活力性质的检测 | 第88-91页 |
| 3.2 APE 2325的酯酶活力性质的测定 | 第91-98页 |
| 4 小结 | 第98-99页 |
| 5 参考文献 | 第99-100页 |
| 第三章 超嗜热酯酶APE 1547稳定性的研究 | 第100-165页 |
| 第一节 APE 1547突变体的构建与酶的分离纯化 | 第100-113页 |
| 1 引言 | 第100页 |
| 2 实验方法 | 第100-104页 |
| 2.1 突变体的构建 | 第100-102页 |
| 2.2 野生型及突变体的分离纯化 | 第102-103页 |
| 2.3 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第103页 |
| 2.4 酯酶活力测定方法 | 第103-104页 |
| 2.5 蛋白质浓度的测定方法 | 第104页 |
| 3 结果与讨论 | 第104-112页 |
| 3.1 突变体的设计 | 第104-106页 |
| 3.2 重组质粒的构建 | 第106-108页 |
| 3.3 野生型和突变体的分离纯化 | 第108-112页 |
| 4 小结 | 第112页 |
| 5 参考文献 | 第112-113页 |
| 第二节 APE 1547及突变体基本酶学性质研究 | 第113-127页 |
| 1 引言 | 第113页 |
| 2 实验方法 | 第113-115页 |
| 2.1 野生型及突变体在不同温度下动力学常数的测定 | 第113页 |
| 2.2 热动力学参数的确定 | 第113-114页 |
| 2.3 野生型及突变体最适pH的测定 | 第114页 |
| 2.4 底物特异性的变化 | 第114页 |
| 2.5 金属离子及表面活性剂对酶活力的影响 | 第114-115页 |
| 3 结果与讨论 | 第115-124页 |
| 3.1 温度对野生型及突变体催化活性的影响 | 第115-119页 |
| 3.2 pH对野生型及突变体催化活性的影响 | 第119-120页 |
| 3.3 底物特异性的变化 | 第120-123页 |
| 3.4 金属离子及表面活性剂对酶活力的影响 | 第123-124页 |
| 4 小结 | 第124-125页 |
| 5 参考文献 | 第125-127页 |
| 第三节 APE 1547及突变体热稳定性的研究 | 第127-146页 |
| 1 引言 | 第127-128页 |
| 2 实验方法 | 第128-129页 |
| 2.1 在最适温度下突变体活力及二级结构随时间变化的研究 | 第128页 |
| 2.2 高温条件下(80～100℃)酯酶热失活曲线的测定 | 第128-129页 |
| 2.3 酶的热失活参数(△G)的确定 | 第129页 |
| 2.4 高温条件下(80～100℃)酯酶荧光光谱的变化 | 第129页 |
| 3 结果与讨论 | 第129-144页 |
| 3.1 在最适温度下突变体活力及二级结构的变化情况 | 第129-132页 |
| 3.2 高温条件下(80～100℃)酯酶热失活曲线的测定 | 第132-135页 |
| 3.3 高温条件下(80～100℃)酯酶荧光光谱的变化 | 第135-141页 |
| 3.4 利用酶的热失活参数解释酶的热稳定性 | 第141-144页 |
| 4 小结 | 第144页 |
| 5 参考文献 | 第144-146页 |
| 第四节 变性剂对APE 1547及突变体稳定性的影响 | 第146-165页 |
| 1 引言 | 第146页 |
| 2 实验方法 | 第146-147页 |
| 2.1 不同浓度的盐酸胍及脲对酶活力的影响 | 第146-147页 |
| 2.2 不同浓度的盐酸胍及脲对酶的内源荧光的影响 | 第147页 |
| 2.3 盐酸胍及脲对酶变性后的复性 | 第147页 |
| 3 结果与讨论 | 第147-163页 |
| 3.1 盐酸胍对野生型及突变型酯酶的影响 | 第147-154页 |
| 3.2 脲对野生型及突变型酯酶的影响 | 第154-163页 |
| 4 小结 | 第163-164页 |
| 5 参考文献 | 第164-165页 |
| 作者简历 | 第165-167页 |
| 中文摘要 | 第167-171页 |
| 英文摘要 | 第171页 |
| 致谢 | 第177-178页 |
