| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词表 | 第8-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-33页 |
| 1.1 基因组编辑技术 | 第12-15页 |
| 1.1.1 基因组编辑技术概述 | 第12-13页 |
| 1.1.2 基因组编辑技术的发展历程 | 第13-15页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统 | 第15-19页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统的技术原理 | 第16-17页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统的晶体结构 | 第17-19页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用 | 第19-27页 |
| 1.3.1 NHEJ介导的基因敲除 | 第19-21页 |
| 1.3.2 HR介导的基因定点插入或替换 | 第21-22页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9系统介导的基因激活与干扰 | 第22-25页 |
| 1.3.4 Cpf1在基因编辑中的应用 | 第25-26页 |
| 1.3.5 其他CRISPR/Cas系统 | 第26-27页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9系统的组装方法 | 第27-28页 |
| 1.4.1 sgRNA的组装方法 | 第27-28页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统的组装方法 | 第28页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑应用中面临的主要问题 | 第28-31页 |
| 1.5.1 脱靶问题 | 第28-30页 |
| 1.5.2 突变基因的传代问题 | 第30页 |
| 1.5.3 靶点效率问题 | 第30-31页 |
| 1.6 学位论文的选题依据、目的和意义 | 第31-33页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第33-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第33-34页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第33页 |
| 2.1.2 载体和菌株 | 第33页 |
| 2.1.3 常用分子生物学试剂 | 第33页 |
| 2.1.4 常用培养基的配置 | 第33-34页 |
| 2.1.5 常用抗生素及常用试剂的配置 | 第34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-56页 |
| 2.2.1 质粒DNA小量提取 | 第34-35页 |
| 2.2.2 质粒DNA大量提取 | 第35-36页 |
| 2.2.3 植物基因组DNA小量提取 | 第36-37页 |
| 2.2.4 微量植物基因组DNA提取 | 第37页 |
| 2.2.5 感受态制备及转化 | 第37-38页 |
| 2.2.6 玉米原生质体转化实验 | 第38-40页 |
| 2.2.7 CRISPR/Cas9系统载体构建 | 第40-43页 |
| 2.2.8 利用CRISPR/Cas9系统打靶基因流程 | 第43-56页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用 | 第56-88页 |
| 3.1 植物CRISPR/Cas9基因组编辑工具箱的建立 | 第56-69页 |
| 3.1.1 用于突变靶基因的CRISPR/Cas9双元载体的构建 | 第56-57页 |
| 3.1.2 构建含有一至多个sgRNA表达框的双元载体 | 第57-59页 |
| 3.1.3 利用玉米原生质体检测不同Cas9及不同sgRNA启动子的活性 | 第59-61页 |
| 3.1.4 利用玉米原生质体检测不同sgRNA的活性 | 第61-62页 |
| 3.1.5 在拟南芥稳定表达中验证CRISPR/Cas9双元载体的活性 | 第62-65页 |
| 3.1.6 用于激活或干扰靶基因的CRISPR/Cas9双元载体的构建 | 第65-66页 |
| 3.1.7 基于RK2-oriV新型骨架CRISPR/Cas9双元载体的构建 | 第66-69页 |
| 3.2 利用融合卵细胞启动子策略提高拟南芥T1代纯合突变体的效率 | 第69-73页 |
| 3.2.1 融合卵细胞启动子双元载体的构建 | 第69页 |
| 3.2.2 T1代转基因拟南芥的突变分析 | 第69-72页 |
| 3.2.3 拟南芥中存在的高频脱靶效应 | 第72-73页 |
| 3.3 利用tRNA-sgRNA策略改善不同靶点间的效率差异 | 第73-76页 |
| 3.3.1 利用tRNA-sgRNA策略构建CRISPR/Cas9双元载体 | 第74页 |
| 3.3.2 T1代转基因拟南芥的突变分析 | 第74-75页 |
| 3.3.3 比较7种不同的tRNA-sgRNA策略 | 第75-76页 |
| 3.4 第二代CRISPR/Cas9基因编辑系统 | 第76-83页 |
| 3.4.1 高特异性CRISPR/Cas9系统的建立 | 第76-78页 |
| 3.4.2 高特异性打靶载体在T2代的突变分析 | 第78-79页 |
| 3.4.3 比较不同高特异性打靶载体在在拟南芥中的突变效率 | 第79-80页 |
| 3.4.4 高特异性Cas9蛋白的高特异性验证 | 第80-82页 |
| 3.4.5 优化的植物靶基因表达调控技术 | 第82-83页 |
| 3.5 CRISPR/Cas9系统中发现的T-DNA插入现象 | 第83-85页 |
| 3.6 Cpf1系统在植物基因组编辑中的初步探索 | 第85-88页 |
| 3.6.1 基于Cpf1系统双元载体的构建 | 第85-86页 |
| 3.6.2 基于Cpf1系统的双元载体在T1代及T2代的突变分析 | 第86-88页 |
| 第四章 讨论 | 第88-92页 |
| 4.1 基于CRISPR/Cas9系统建立植物基因组编辑工具箱 | 第88页 |
| 4.2 利用EC1.2en-EC1.1p融合策略大大提高拟南芥T1代多基因纯合突变体的突变效率 | 第88-89页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的脱靶效应 | 第89页 |
| 4.4 只有将tRNA与sgRNA~(Mutant)融合时tRNA才能更好地发挥作用 | 第89-90页 |
| 4.5 CRISPR/Cas9基因组编辑系统 | 第90页 |
| 4.6 CRISPR/Cas9系突变位点的检测 | 第90-92页 |
| 第五章 结论与展望 | 第92-93页 |
| 5.1 主要结论 | 第92页 |
| 5.2 展望 | 第92-93页 |
| 附录 | 第93-104页 |
| 参考文献 | 第104-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 个人简历 | 第113页 |
