| 摘要 | 第10-15页 |
| ABSTRACT | 第15-20页 |
| 缩略词中英文对照表 | 第21-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-54页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统介绍 | 第23-38页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第23页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的结构组成 | 第23-27页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第27-28页 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas系统在细菌生理中的作用 | 第28-31页 |
| 1.1.5 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第31-35页 |
| 1.1.6 CRISPR/Cas9系统脱靶效应与生物信息学工具 | 第35-36页 |
| 1.1.7 CRISPR/Cas9系统与其他基因组编辑方法比较 | 第36-38页 |
| 1.2 粘细菌的次级代谢概述 | 第38-44页 |
| 1.2.1 粘细菌及其次级代谢产物 | 第38-40页 |
| 1.2.2 粘细菌次级代谢产物的调控与发掘 | 第40-41页 |
| 1.2.3 合成生物学在粘细菌次级代谢中的应用 | 第41-44页 |
| 1.3 DNA聚合酶简介 | 第44-51页 |
| 1.3.1 DNA聚合酶的发现 | 第44页 |
| 1.3.2 DNA聚合酶分类 | 第44-47页 |
| 1.3.3 DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构与功能 | 第47-48页 |
| 1.3.4 细菌DNA聚合酶Ⅲα亚基的研究 | 第48-50页 |
| 1.3.5 DnaE2目前的研究 | 第50-51页 |
| 1.4 本课题开展思路及研究内容 | 第51-54页 |
| 第二章 黄色粘球CRISPR系统的功能分析 | 第54-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第55-60页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第55-56页 |
| 2.1.2 培养基 | 第56-57页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第57-59页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第59-60页 |
| 2.1.5 软件工具与数据库 | 第60页 |
| 2.2 实验方法 | 第60-67页 |
| 2.2.1 CRISPR的生物学分析 | 第60-61页 |
| 2.2.2 CRISPR1-3敲除载体载体构建 | 第61-63页 |
| 2.2.3 CRISPR1-3敲除突变株的构建 | 第63-64页 |
| 2.2.4 发育与生孢检测 | 第64-65页 |
| 2.2.5 运动检测 | 第65页 |
| 2.2.6 胞外多糖EPS检测 | 第65页 |
| 2.2.7 自然转化效率测定 | 第65-67页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第67-78页 |
| 2.3.1 黄色粘球菌自身CRISPR系统的分析 | 第67-72页 |
| 2.3.2 构建黄色粘球菌自身CRISPR系统缺失菌株 | 第72-74页 |
| 2.3.3 CRISPR系统敲除菌株发育生孢与运动分析 | 第74-76页 |
| 2.3.4 CRISPR系统敲除菌株胞外多糖与自然转化研究 | 第76-78页 |
| 2.4 本章小结 | 第78-79页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9对粘球菌基因组片段的敲除 | 第79-115页 |
| 3.1 实验材料 | 第83-86页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第83-85页 |
| 3.1.2 培养基 | 第85页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第85-86页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第86页 |
| 3.1.5 软件工具及数据库 | 第86页 |
| 3.2 实验方法 | 第86-99页 |
| 3.2.1 菌株及培养条件 | 第86-87页 |
| 3.2.2 质粒与菌株构建 | 第87-98页 |
| 3.2.3 荧光检测 | 第98页 |
| 3.2.4 突变株PCR验证与测序验证 | 第98页 |
| 3.2.5 突变株产物TA的检测 | 第98-99页 |
| 3.3 实验结果 | 第99-113页 |
| 3.3.1 在黄色粘球菌中建立CRISPR/Cas9系统 | 第99-103页 |
| 3.3.2 选取合适的靶向序列以减少脱靶率 | 第103-104页 |
| 3.3.3 向黄色粘球菌中引入NHEJ系统 | 第104-106页 |
| 3.3.4 黄色粘球菌CRISPR/Cas9+NHEJ敲除测试 | 第106-110页 |
| 3.3.5 在黄色粘球菌中利用CRISPR/Cas9+HDR进行敲除 | 第110-113页 |
| 3.4 本章小结 | 第113-115页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9对埃博霉素基因簇的转录激活 | 第115-140页 |
| 4.1 实验材料 | 第117-119页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第117-119页 |
| 4.1.2 培养基 | 第119页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第119页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第119页 |
| 4.1.5 软件工具及数据库 | 第119页 |
| 4.2 实验方法 | 第119-123页 |
| 4.2.1 菌株及培养条件 | 第119页 |
| 4.2.2 激活相关质粒和突变株构建 | 第119-120页 |
| 4.2.3 荧光检测 | 第120-121页 |
| 4.2.4 突变株发酵和产物检测 | 第121页 |
| 4.2.5 RT-qPCR | 第121-123页 |
| 4.3 实验结果 | 第123-138页 |
| 4.3.1 密码子优化的dCas9-激活因子在黄色粘球菌中正常工作 | 第123-126页 |
| 4.3.2 用作激活的sgRNA的设计原理 | 第126-129页 |
| 4.3.3 RNA聚合酶的Omega亚基作为激活因子激活埃博霉素基因簇 | 第129-132页 |
| 4.3.4 不同的激活因子对于激活的影响 | 第132-136页 |
| 4.3.5 诱导型启动子操控的激活 | 第136-138页 |
| 4.4 本章小结 | 第138-140页 |
| 第五章 双拷贝DNA聚合酶Ⅲα亚基的功能分析 | 第140-161页 |
| 5.1 实验材料 | 第141-143页 |
| 5.1.1 菌株及质粒 | 第141-142页 |
| 5.1.2 培养基 | 第142-143页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第143页 |
| 5.1.4 主要仪器设备 | 第143页 |
| 5.1.5 软件工具及数据库 | 第143页 |
| 5.2 实验方法 | 第143-147页 |
| 5.2.1 构建黄色粘球菌敲除突变株 | 第143-144页 |
| 5.2.2 dnaE2基因的回补和过表达 | 第144页 |
| 5.2.3 突变率测定 | 第144-145页 |
| 5.2.4 发育与生孢实验 | 第145页 |
| 5.2.5 RNA提取和荧光定量PCR实验 | 第145-146页 |
| 5.2.6 生物信息学分析 | 第146-147页 |
| 5.3 实验结果与分析 | 第147-159页 |
| 5.3.1 dnaE2可删除且在黄色粘球菌中编码易错的DNA聚合酶 | 第147-151页 |
| 5.3.2 敲除dnaE2对黄色粘球菌社会学行为的影响 | 第151页 |
| 5.3.3 dnaE2在发育阶段染色体复制中发挥的功能 | 第151-152页 |
| 5.3.4 dnaE1的表达水平远高于dnaE2 | 第152-153页 |
| 5.3.5 dnaE2的过表达提高了生长能力、发育能力和突变率 | 第153-155页 |
| 5.3.6 不同的dnaE2突变株的萘啶酸抗性突变型 | 第155-156页 |
| 5.3.7 过表达dnaE2不能替换dnaE1 | 第156-159页 |
| 5.4 本章小结 | 第159-161页 |
| 总结与展望 | 第161-163页 |
| 附录 | 第163-176页 |
| 附录一: 质粒图谱 | 第163-167页 |
| 附录二: 论文中各种PCR所用引物 | 第167-176页 |
| 参考文献 | 第176-195页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第195-196页 |
| 致谢 | 第196-197页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第197页 |
