| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-30页 |
| 1 概述 | 第15页 |
| 2 自噬和凋亡的研究进展 | 第15-23页 |
| 2.1 自噬的存活功能 | 第15-16页 |
| 2.2 自噬的分子机制 | 第16-17页 |
| 2.3 凋亡 | 第17-19页 |
| 2.4 自噬与凋亡的关系 | 第19-20页 |
| 2.5 钙离子和凋亡 | 第20-21页 |
| 2.6 钙离子与自噬 | 第21-23页 |
| 3 昆虫组织重建过程中发生的程序性细胞死亡（PCD）及调控机制 | 第23-29页 |
| 3.1 昆虫蜕皮与变态 | 第23-24页 |
| 3.2 昆虫PCD | 第24-26页 |
| 3.3 20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E) | 第26页 |
| 3.4 昆虫发育过程中20E的滴度变化 | 第26-27页 |
| 3.5 20E介导的PCD | 第27-28页 |
| 3.6 20E介导的钙信号 | 第28-29页 |
| 4 存在的科学问题及实验方案 | 第29-30页 |
| 第二章 类固醇激素20-羟基蜕皮酮通过增加细胞内钙离子水平促进自噬向凋亡的转化 | 第30-72页 |
| 1 引言 | 第30-31页 |
| 2 实验材料与方法 | 第31-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第31-32页 |
| 2.1.2 实验细胞系 | 第32页 |
| 2.1.3 实验所用试剂 | 第32页 |
| 2.1.4 实验所用仪器 | 第32-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-43页 |
| 2.2.1 提取虫体组织RNA并合成cDNA | 第33页 |
| 2.2.2 细胞总RNA的提取并合成cDNA | 第33页 |
| 2.2.3 虫体组织蛋白提取 | 第33-34页 |
| 2.2.4 细胞系蛋白提取 | 第34页 |
| 2.2.5 基因克隆 | 第34页 |
| 2.2.6 半定量PCR | 第34-35页 |
| 2.2.7 实时定量PCR (Quantitative Real Time PCR,qRT-PCR) | 第35-36页 |
| 2.2.8 制备多克隆抗体 | 第36-37页 |
| 2.2.8.1 构建原核表达载体 | 第36页 |
| 2.2.8.2 融合蛋白表达、纯化 | 第36-37页 |
| 2.2.8.3 制备多克隆抗体 | 第37页 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印迹(Western blot) | 第37-38页 |
| 2.2.10 穿膜肽融合蛋白的制备 | 第38页 |
| 2.2.11 虫体激素诱导 | 第38页 |
| 2.2.12 细胞系激素诱导 | 第38页 |
| 2.2.13 免疫组织化学 | 第38-39页 |
| 2.2.14 HE染色 | 第39页 |
| 2.2.15 虫体干扰 | 第39-40页 |
| 2.2.15.1 dsRNA合成 | 第39-40页 |
| 2.2.15.2 虫体注射daRNA | 第40页 |
| 2.2.15.3 细胞系干扰 | 第40页 |
| 2.2.16 细胞系转染 | 第40-41页 |
| 2.2.16.1 过表达载体构建 | 第40-41页 |
| 2.2.16.2 过表达质粒转染细胞系 | 第41页 |
| 2.2.17 细胞系不同Ca~(2+)浓度诱导 | 第41页 |
| 2.2.18 钙离子浓度检测 | 第41-42页 |
| 2.2.18.1 组织内钙离子浓度检测 | 第41页 |
| 2.2.18.2 细胞系中钙离子水平检测 | 第41-42页 |
| 2.2.19 细胞自噬检测 | 第42页 |
| 2.2.20 细胞系中Caspase 3活性检测 | 第42页 |
| 2.2.21 细胞凋亡检测 | 第42页 |
| 2.2.22 细胞死亡检测 | 第42-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-68页 |
| 3.1 棉铃虫自噬相关基因(ATGs)和细胞凋亡蛋白酶基因(Caspases)的鉴定 | 第43-45页 |
| 3.2 原核表达纯化后的ATG5、LC3蛋白以及抗体特异性检测 | 第45-46页 |
| 3.3 中肠ATGs和Caspases在变态期高表达 | 第46-48页 |
| 3.4 20E诱导ATGs和Caspases表达上调 | 第48-49页 |
| 3.5 ATG5、LC3以及Caspase-3在中肠中的表达模式是变化的 | 第49-50页 |
| 3.6 LC3,Caspase-3在中肠组织中的定位 | 第50-51页 |
| 3.7 20E诱导自噬 | 第51-54页 |
| 3.7.1 20E诱导LC3-Ⅱ的形成以时间和浓度依赖的方式 | 第51-53页 |
| 3.7.2 20E诱导自噬体的形成 | 第53-54页 |
| 3.8 20E诱导凋亡 | 第54-55页 |
| 3.9 20E诱导自噬先于凋亡的发生 | 第55-56页 |
| 3.10 高浓度20E诱导凋亡,相对较低浓度20E诱导自噬 | 第56-57页 |
| 3.11 凋亡依赖于自噬 | 第57-62页 |
| 3.11.1 ATG5干扰或施加自噬抑制剂会降低Caspase-3的活化 | 第57-58页 |
| 3.11.2 ATG5干扰或施加自噬抑制剂会降低Caspase-3的活性 | 第58-59页 |
| 3.11.3 干扰ATG7或12会抑制Caspase-3的活化 | 第59-60页 |
| 3.11.4 干扰ATG5、7或12会抑制凋亡 | 第60-61页 |
| 3.11.5 干扰ATG5抑制自噬、凋亡和中肠PCD | 第61-62页 |
| 3.12 Ca~(2+)决定自噬向凋亡的转化 | 第62-68页 |
| 3.12.1 Ca~(2+)决定20E诱导的NtATG5,片段化Caspase-3的形成及凋亡 | 第62-64页 |
| 3.12.2 Ca~(2+)决定20E诱导的自噬向凋亡的转化 | 第64-65页 |
| 3.12.3 中肠内钙离子浓度的增加依赖于20E浓度 | 第65-66页 |
| 3.12.4 20E诱导细胞内钙离子水平的升高以浓度依赖的方式在棉铃虫HaEpi细胞中 | 第66页 |
| 3.12.5 钙离子将20E诱导的自噬转化为凋亡 | 第66-68页 |
| 4 讨论 | 第68-71页 |
| 4.1 20E诱导自噬向凋亡的转化依赖于20E的剂量 | 第68-69页 |
| 4.2 20E诱导细胞内钙离子水平的增加促进NtATG5的形成将自噬转化为凋亡 | 第69-70页 |
| 4.3 在20E诱导的中肠PCD过程中,自噬相关蛋白是凋亡所必须的 | 第70-71页 |
| 5 结论 | 第71-72页 |
| 创新点总结与意义 | 第72页 |
| 论文的不足之处 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 在读期间已发表和准备发表的文章 | 第84-85页 |
| 附件 | 第85页 |
