| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 中文文摘 | 第4-10页 |
| 绪论 | 第10-24页 |
| 1 Burkholderia sp.脂肪酶概述和应用 | 第10-14页 |
| ·Burkholderia sp.脂肪酶概述 | 第10页 |
| ·Burkholderia sp.脂肪酶的应用 | 第10-14页 |
| 2 影响酶热稳定性的因素 | 第14-17页 |
| ·氢键的形成 | 第14-15页 |
| ·蛋白内部的疏水性包装 | 第15页 |
| ·增加二级结构倾向性(propensity)和优化二级结构 | 第15-16页 |
| ·盐桥的优化 | 第16页 |
| ·不稳定的氨基酸残基 | 第16-17页 |
| ·二硫键的引入 | 第17页 |
| 3 酶分子的蛋白质工程改造策略 | 第17-20页 |
| ·随机诱变 | 第18-19页 |
| ·半理性设计 | 第19-20页 |
| ·理性设计 | 第20页 |
| 4 课题研究的背景、内容及意义 | 第20-24页 |
| ·本课题的研究背景和意义 | 第20-21页 |
| ·本研究的主要内容 | 第21-24页 |
| 第一章 突变位点的筛选 | 第24-30页 |
| 1 前言 | 第24页 |
| 2 实验材料 | 第24页 |
| 3 实验方法 | 第24-27页 |
| ·筛选适于构建Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA分子3D结构模型的晶体模板 | 第25页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA 3D结构模型的构建 | 第25页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA突变位点的筛选 | 第25-26页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA突变位点的可视化 | 第26-27页 |
| 4 结果与分析 | 第27-29页 |
| ·构建Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶3D结构模型的模板选择 | 第27页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA 3D结构模型的构建 | 第27页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA突变位点的筛选 | 第27-28页 |
| ·Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA突变位点的可视化 | 第28-29页 |
| 5 小结和讨论 | 第29-30页 |
| 第二章 突变体的构建及筛选 | 第30-46页 |
| 1 前言 | 第30页 |
| 2 实验材料 | 第30-32页 |
| ·菌株和质粒 | 第30页 |
| ·培养基和试剂 | 第30-32页 |
| ·实验设备 | 第32页 |
| 3 实验方法 | 第32-39页 |
| ·质粒pACYC-lipA-lipB的提取 | 第33页 |
| ·E coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第33-34页 |
| ·E coli BL21(DE3)感受态的验证 | 第34页 |
| ·突变文库的构建 | 第34-36页 |
| ·突变文库多样性和质量的评价 | 第36页 |
| ·lipA的诱导表达 | 第36-37页 |
| ·脂肪酶酶活的测定 | 第37-38页 |
| ·热稳定性提高的脂肪酶突变体的筛选 | 第38页 |
| ·脂肪酶突变体热稳定性的测定 | 第38-39页 |
| 4 结果和分析 | 第39-44页 |
| ·质粒pACYC-lipA-lipB的提取 | 第39页 |
| ·PCR产物纯化 | 第39页 |
| ·突变文库质量评价 | 第39-40页 |
| ·pNP标准曲线的绘制 | 第40页 |
| ·不同突变文库中正突变类型及效应 | 第40-42页 |
| ·野生型脂肪酶及其突变体的T_(50)~(12)值测定 | 第42页 |
| ·野生型脂肪酶及其突变体t_(1/2)的测定 | 第42-43页 |
| ·脂肪酶突变体稳定性提高的分子机制分析 | 第43-44页 |
| 5 小结和讨论 | 第44-46页 |
| 第三章 野生型脂肪酶和突变体脂肪酶的纯化 | 第46-58页 |
| 1 前言 | 第46页 |
| 2 实验材料 | 第46-49页 |
| ·菌株 | 第46页 |
| ·培养基和试剂 | 第46-48页 |
| ·实验设备 | 第48-49页 |
| 3 实验方法 | 第49-54页 |
| ·E coli BL21(DE3)感受态的制备 | 第49页 |
| ·E coli BL21(DE3)感受态的验证 | 第49页 |
| ·突变体LipA-V~(223)S的构建 | 第49-50页 |
| ·突变体LipA-V~(223)S残余酶活的测定 | 第50页 |
| ·野生型脂肪酶和3种突变体脂肪酶粗酶液的制备 | 第50-51页 |
| ·脂肪酶LipA的纯化 | 第51页 |
| ·SDS-PAGE蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第51-52页 |
| ·Western Blotting | 第52-53页 |
| ·脂肪酶LipA纯化条件的探索 | 第53-54页 |
| 4 结果和分析 | 第54-57页 |
| ·突变体LipA-V~(223)S的测序结果 | 第54-55页 |
| ·突变体LipA-V~(223)S脂肪酶和野生型脂肪酶的残余酶活的测定 | 第55页 |
| ·脂肪酶LipA及其突变体的纯化 | 第55-56页 |
| ·Western Blotting | 第56页 |
| ·脂肪酶LipA纯化条件的摸索 | 第56-57页 |
| 5 小结和讨论 | 第57-58页 |
| 第四章 结论与展望 | 第58-60页 |
| 1 结论 | 第58页 |
| 2 展望 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第68-70页 |
| 致谢 | 第70-72页 |
| 个人简历 | 第72-76页 |
