| 中文摘要 | 第1-18页 |
| ABSTRACT | 第18-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-40页 |
| ·Ran GTPase蛋白概述 | 第21-23页 |
| ·Ran介导核质运输 | 第23-24页 |
| ·Ran在细胞有丝分裂中的调控功能 | 第24-27页 |
| ·功能多样性 | 第25页 |
| ·纺锤体组装的RanGTP浓度梯度调控机制 | 第25-26页 |
| ·Ran释放纺锤体组装因子机制 | 第26-27页 |
| ·Ran参与细胞凋亡 | 第27-28页 |
| ·Ran调控凋亡细胞微管重排 | 第27页 |
| ·凋亡早期RanGTP浓度梯度耗散 | 第27-28页 |
| ·模式生物嗜热四膜虫进行细胞生物学研究的优势 | 第28-31页 |
| ·四膜虫生物学特征 | 第28-30页 |
| ·四膜虫的研究条件 | 第30页 |
| ·四膜虫内成熟的基因重组技术 | 第30-31页 |
| ·四膜虫无性生殖细胞周期 | 第31-33页 |
| ·四膜虫无性生殖细胞周期进程 | 第31-32页 |
| ·四膜虫大核无丝分裂特点 | 第32页 |
| ·大核无丝分裂微管组装 | 第32-33页 |
| ·四膜虫程序性核死亡研究进展 | 第33-36页 |
| ·四膜虫程序性核死亡概述 | 第34-35页 |
| ·线粒体在程序性核死亡中的功能 | 第35-36页 |
| ·AIF途径参与核程序性死亡过程 | 第36页 |
| ·本研究立题依据与总体设计 | 第36-40页 |
| ·研究背景和意义 | 第36-38页 |
| ·研究内容与技术路线 | 第38-40页 |
| 第二章 嗜热四膜虫RAN1基因的鉴定及序列分析 | 第40-51页 |
| ·引言 | 第40页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·细胞株、菌株及质粒 | 第40-41页 |
| ·试剂及工具酶 | 第41页 |
| ·仪器设备 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-42页 |
| ·RAN1基因生物信息学分析 | 第41页 |
| ·四膜虫的培养 | 第41页 |
| ·PCR扩增和测序 | 第41页 |
| ·四膜虫RNA的提取及cDNA的合成 | 第41-42页 |
| ·实时荧光定量PCR分析RAN1基因表达 | 第42页 |
| ·Ran1辅助调控蛋白保守结构域分析 | 第42页 |
| ·结果 | 第42-49页 |
| ·四膜虫中RAN1基因及其蛋白质序列 | 第42-44页 |
| ·四膜虫Ran1保守功能结构域分析 | 第44-46页 |
| ·四膜虫Ran1蛋白与其它物种Ran蛋白的同源性分析 | 第46-47页 |
| ·RAN1基因表达谱分析 | 第47-48页 |
| ·四膜虫各Ran1辅助调控蛋白功能结构域分析 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-50页 |
| ·小结 | 第50-51页 |
| 第三章 嗜热四膜虫Ran1参与调控无性生殖过程大核无丝分裂 | 第51-86页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·材料 | 第51-55页 |
| ·细胞株、菌株及质粒 | 第51-52页 |
| ·试剂及工具酶 | 第52-54页 |
| ·仪器设备 | 第54-55页 |
| ·方法 | 第55-61页 |
| ·四膜虫细胞的培养和同步化诱导 | 第55页 |
| ·四膜虫大核基因组DNA的提取 | 第55页 |
| ·RAN1基因定点突变 | 第55-56页 |
| ·内源性表达HA-Ran1 WT/T25N/Q70L融合蛋白四膜虫细胞株的构建 | 第56-57页 |
| ·过表达HA-Ran1结构域及突变体四膜虫细胞株的构建 | 第57-58页 |
| ·RAN1基因敲除四膜虫细胞株的构建 | 第58-59页 |
| ·Western blot检测HA-Ran1及其突变蛋白的表达 | 第59页 |
| ·间接免疫荧光法分析HA-Ran1及其突变体蛋白的定位 | 第59-60页 |
| ·间接免疫荧光法分析无丝分裂大核内微管组装 | 第60页 |
| ·核质荧光信号比计算 | 第60页 |
| ·标准曲线法实时荧光定量PCR | 第60-61页 |
| ·结果1：Ran1及其模拟GDP和GTP锁定形式的突变体在嗜热四膜虫大核无丝分裂过程的定位 | 第61-68页 |
| ·HA-Ran1 WT/T25N/Q70L细胞株的构建及鉴定 | 第61-64页 |
| ·HA-Ran1 WT/T25N/Q70L在四膜虫大核无丝分裂过程的定位 | 第64-66页 |
| ·Ran1蛋白单独辅助因子结合结构域及缺失突变细胞株的构建及鉴定 | 第66-67页 |
| ·过表达的HA-GAP/BP1/GEF/C-del在四膜虫大核无丝分裂过程的定位 | 第67-68页 |
| ·结果2：部分敲除RAN1基因对四膜虫大核无丝分裂的影响 | 第68-74页 |
| ·RAN1部分敲除细胞株iΔRAN1的构建及鉴定 | 第68-70页 |
| ·iΔRAN1细胞株大核无丝分裂表型分析 | 第70-72页 |
| ·iΔRAN1细胞株无丝分裂大核核内微管组装 | 第72-74页 |
| ·结果3：过表达Ran1及其模拟GTP、GDP锁定形式的突变体对四膜虫大核无丝分裂的影响 | 第74-81页 |
| ·过表达Ran1 WT/T25N/Q70L细胞株OERan1 WT/T25N/Q70L的构建及鉴定 | 第74-75页 |
| ·过表达Ran1 WT/T25N/Q70L对四膜虫繁殖速度的影响 | 第75-76页 |
| ·OERan1 WT/T25N/Q70L细胞株大核无丝分裂表型分析 | 第76-78页 |
| ·过表达Ran1 WT/T25N/Q70L对无丝分裂大核内微管组装的影响 | 第78-79页 |
| ·过表达的HA-Ran1 WT/T25N/Q70L在四膜虫大核无丝分裂过程的定位 | 第79-81页 |
| ·讨论 | 第81-84页 |
| ·Ran1及其GTP、GDP锁定形式突变体的分布形式揭示Ran1 GDP/GTP循环的存在 | 第81-82页 |
| ·RAN1基因是四膜虫无丝分裂大核核内微管正常组装所必需的 | 第82-83页 |
| ·破坏Ran1 GDP/GTP循环平衡抑制大核无丝分裂核内微管组装 | 第83-84页 |
| ·小结 | 第84-86页 |
| 第四章 嗜热四膜虫Ran1参与调控有性生殖过程亲本大核程序性核死亡 | 第86-113页 |
| ·引言 | 第86-87页 |
| ·材料 | 第87-89页 |
| ·细胞株、菌株及质粒 | 第87页 |
| ·试剂及工具酶 | 第87-89页 |
| ·仪器设备 | 第89页 |
| ·方法 | 第89-93页 |
| ·四膜虫细胞的接合配对 | 第89页 |
| ·内源性表达HA-AIF细胞株的构建 | 第89-90页 |
| ·内源性表达HA-AIF的RAN1不完全敲除细胞株的构建 | 第90页 |
| ·内源性表达HA-AIF的RAN1基因突变细胞株的构建 | 第90-91页 |
| ·过表达HA-importin α1全长及截短突变体细胞株的构建 | 第91-92页 |
| ·过表达HA-Ima1~△-AIF融合蛋白的RAN1部分敲除细胞株的构建 | 第92-93页 |
| ·吖啶橙和Hoechst 33342活体荧光染料双染法检测凋亡细胞核 | 第93页 |
| ·线粒体活体染色及观察 | 第93页 |
| ·间接免疫荧光法分析HA-融合蛋白的定位 | 第93页 |
| ·结果 | 第93-111页 |
| ·部分敲除基因对四膜虫接合期核发育及亲本大核PND进程的影响 | 第93-97页 |
| ·HA-Ran1 WT/T25N/Q70L在四膜虫接合生殖过程的定位 | 第97-101页 |
| ·iARAN1/HA-AIF和WT/HA-AIF细胞株的构建和鉴定 | 第101-102页 |
| ·部分敲除RAN1基因对四膜虫亲本大核PND过程AIF核输入的影响 | 第102-104页 |
| ·Ran1T25N/HA-AIF和Ran1Q70L/HA-AIF细胞株的构建及鉴定 | 第104-105页 |
| ·模拟GDP/GTP不同锁定形式的Ran1突变体对亲本大核PND过程中AIF核输入的影响 | 第105页 |
| ·不依赖于Ran1的核输入系统的建立 | 第105-107页 |
| ·不依赖于Ran1的AIF核输入对iΔRAN1细胞中亲本大核PND进程的恢复效应 | 第107-111页 |
| ·讨论 | 第111-112页 |
| ·小结 | 第112-113页 |
| 总结与展望 | 第113-116页 |
| 附录 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-131页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第131-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 个人简况及联系方式 | 第134-136页 |
