| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-14页 |
| 引言 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-27页 |
| ·甲壳素及壳聚糖结构与性质 | 第15-16页 |
| ·甲壳素的结构与性质 | 第15页 |
| ·壳聚糖的结构与性质 | 第15-16页 |
| ·壳寡糖的性质与应用 | 第16-19页 |
| ·壳寡糖的性质 | 第16-18页 |
| ·壳寡糖的水溶性、吸湿性、保湿性 | 第16-17页 |
| ·抗菌抑菌作用 | 第17页 |
| ·减肥与降低胆固醇的作用 | 第17页 |
| ·抗肿瘤活性 | 第17-18页 |
| ·壳寡糖的应用现状 | 第18-19页 |
| ·壳寡糖的食品中的应用 | 第18页 |
| ·壳寡糖的化妆品中的应用 | 第18页 |
| ·壳寡糖在生物医学领域的应用 | 第18-19页 |
| ·壳寡糖在农业中的应用 | 第19页 |
| ·壳寡糖的制备 | 第19-23页 |
| ·化学法 | 第19-20页 |
| ·酸水解法 | 第19-20页 |
| ·氧化降解法 | 第20页 |
| ·物理法 | 第20-21页 |
| ·超声波和微波法 | 第20页 |
| ·γ射线照射下辐射降解 | 第20页 |
| ·光降解 | 第20-21页 |
| ·酶降解法 | 第21-23页 |
| ·甲壳素脱乙酰酶 | 第21-22页 |
| ·专一性酶 | 第22-23页 |
| ·壳聚糖酶 | 第22页 |
| ·几丁质酶 | 第22-23页 |
| ·溶菌酶 | 第23页 |
| ·非专一性酶降解法 | 第23页 |
| ·混合酶降解法 | 第23页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第23-26页 |
| ·表达菌株 | 第23-24页 |
| ·表达载体 | 第24-25页 |
| ·启动子 | 第24页 |
| ·信号肽 | 第24页 |
| ·选择性标记 | 第24-25页 |
| ·外源基因的整合 | 第25页 |
| ·外源蛋白的表达 | 第25-26页 |
| ·外源蛋白的表达的步骤 | 第25页 |
| ·外源蛋白的翻译后修饰 | 第25-26页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的特点 | 第26页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的优点 | 第26页 |
| ·毕赤酵母表达外源蛋白的缺点 | 第26页 |
| ·本文的研究意义与目的 | 第26-27页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第27-45页 |
| ·材料 | 第27-34页 |
| ·菌株和质粒 | 第27-28页 |
| ·菌株 | 第27页 |
| ·质粒表 | 第27-28页 |
| ·培养基 | 第28页 |
| ·试剂和酶 | 第28页 |
| ·试剂 | 第28页 |
| ·酶 | 第28页 |
| ·试剂盒 | 第28页 |
| ·仪器和设备 | 第28-29页 |
| ·实验主要涉及的溶液 | 第29-30页 |
| ·质粒提取所用的溶液 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE溶液 | 第29-30页 |
| ·其他溶液 | 第30页 |
| ·引物 | 第30-34页 |
| ·有关CSN-P的引物 | 第30-32页 |
| ·有关CLCD的引物 | 第32-34页 |
| ·方法 | 第34-45页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第34-35页 |
| ·琼脂糖凝胶回收目的DNA片段 | 第35页 |
| ·Muts处理PCR产物的方法 | 第35页 |
| ·非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第35-36页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶回收DNA | 第36页 |
| ·PCR产物的T4 DNA聚合酶处理 | 第36-37页 |
| ·质粒DNA的抽提及纯化 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞制备 | 第38页 |
| ·大肠杆菌的常规转化 | 第38-39页 |
| ·外源基因在大肠杆菌中的诱导与表达 | 第39页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达 | 第39页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达 | 第39-40页 |
| ·SDS-PAGE检测表达蛋白 | 第40-41页 |
| ·目的蛋白的质谱验证 | 第41-42页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第42页 |
| ·壳聚糖酶的酶学性质分析 | 第42-43页 |
| ·酶活测定方法 | 第42-43页 |
| ·pH对壳聚糖酶活性的影响 | 第43页 |
| ·温度对壳聚糖酶活性的影响 | 第43页 |
| ·壳聚糖酶的热稳定性分析 | 第43页 |
| ·各种添加剂对壳聚糖酶的影响 | 第43页 |
| ·壳聚糖酶水解产物的分析 | 第43-44页 |
| ·壳聚糖大规模水解条件 | 第43-44页 |
| ·TLC分析壳聚糖酶水解产物 | 第44页 |
| ·质谱分析壳聚糖酶水解产物 | 第44页 |
| ·糖基化分析 | 第44-45页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第45-70页 |
| ·壳聚糖酶的克隆、表达及酶学性质 | 第45-60页 |
| ·CSN-P密码子优化前后clustalw2软件比对结果 | 第45页 |
| ·CSN-P基因的合成 | 第45-47页 |
| ·CSN-P毕赤酵母表达载体的构建 | 第47-49页 |
| ·pHBM-CSN-P的毕赤酵母转化及转化子的鉴定 | 第49-50页 |
| ·CSN-P在毕赤酵母中的表达 | 第50页 |
| ·CSN-P酶学性质分析 | 第50-55页 |
| ·pH对CSN-P的活性的影响 | 第50-51页 |
| ·温度对CSN-P的活性的影响 | 第51-54页 |
| ·CSN-P最适温度的测定 | 第51-52页 |
| ·温度对CSN-P的热稳定性的影响 | 第52-54页 |
| ·不同添加剂对CSN-P活性的影响 | 第54-55页 |
| ·CSN-P的糖基化分析 | 第55-57页 |
| ·CSN-P水解产物的成分分析 | 第57-58页 |
| ·CSN-P对不同脱乙酰度壳聚糖水解效果的比较分析 | 第58-60页 |
| ·脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质 | 第60-65页 |
| ·CLCD密码子优化前后clustalw2软件比对结果 | 第60页 |
| ·CLCD基因的合成 | 第60-62页 |
| ·CLCD毕赤酵母表达载体的构建 | 第62-64页 |
| ·pHBM-CLCD的毕赤酵母转化及转化子的鉴定 | 第64-65页 |
| ·CLCD在毕赤酵母中的表达及SDS-PAGE分析 | 第65页 |
| ·CLCD与CSN-P制备均匀脱乙酰度的壳寡糖 | 第65-70页 |
| ·CLCD对CSN-P水解产物中壳三糖的作用 | 第65-66页 |
| ·CLCD对CSN-P水解产物中壳四糖的作用 | 第66-67页 |
| ·CLCD对CSN-P水解产物中壳五糖的作用 | 第67-68页 |
| ·CLCD对CSN-P水解产物中壳六糖的作用 | 第68-70页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第70-74页 |
| ·本研究制备壳寡糖方法的优点 | 第70-71页 |
| ·CSN-P酶学性质的优越性 | 第70-71页 |
| ·本研究制备壳寡糖技术路线的优越性 | 第71页 |
| ·CSN-P水解壳聚糖及CLCD水解壳寡糖的作用机理 | 第71-72页 |
| ·展望 | 第72-74页 |
| ·CSN-P及CLCD毕赤酵母转化子高表达量的筛选 | 第72页 |
| ·CLCD最佳水解条件的探索 | 第72页 |
| ·CSN-P水解壳聚糖产物及CLCD水解壳寡糖产物的功能研究 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
