| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 前言 | 第10-12页 |
| 1. 课题研究的背景及意义 | 第10页 |
| 2. 本论文主要研究内容 | 第10-11页 |
| 3. 本论文创新之处 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| ·漆酶的来源 | 第12页 |
| ·漆酶的化学组成 | 第12-13页 |
| ·漆酶的结构及催化机制 | 第13-15页 |
| ·漆酶的结构 | 第13-14页 |
| ·漆酶的催化机制 | 第14-15页 |
| ·漆酶的酶学性质 | 第15页 |
| ·漆酶及其基因的研究进展 | 第15-18页 |
| ·漆酶基因的克隆及异源表达 | 第15-17页 |
| ·漆酶基因的改造 | 第17-18页 |
| ·漆酶的应用 | 第18-22页 |
| ·在造纸工业中的应用 | 第18页 |
| ·在环境保护中的应用 | 第18-20页 |
| ·在生物检测中的应用 | 第20-21页 |
| ·在食品工业中的应用 | 第21-22页 |
| 第二章 杂色云芝漆酶基因的克隆 | 第22-35页 |
| ·材料与方法 | 第22-24页 |
| ·菌株及质粒 | 第22页 |
| ·药品与酶 | 第22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第23-24页 |
| ·实验方法 | 第24-29页 |
| ·杂色云芝总RNA的提取 | 第24-25页 |
| ·将mRNA反转录为cDNA一链 | 第25页 |
| ·漆酶基因的克隆 | 第25-26页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第26页 |
| ·目的片段的回收 | 第26-27页 |
| ·DNA浓缩 | 第27页 |
| ·PCR产物的TA克隆 | 第27页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第27-28页 |
| ·质粒小量提取 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的PCR验证 | 第29页 |
| ·结果与分析 | 第29-34页 |
| ·总RNA提取 | 第29页 |
| ·全序列获得 | 第29-30页 |
| ·阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第30页 |
| ·核苷酸序列及同源性分析 | 第30-34页 |
| ·小结 | 第34-35页 |
| 第三章 漆酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第35-51页 |
| ·材料与方法 | 第35-37页 |
| ·菌株及质粒 | 第35页 |
| ·药品与酶 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·引物设计 | 第36页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-44页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·PCR扩增产物的割胶回收 | 第38页 |
| ·PCR扩增产物的双酶切 | 第38-39页 |
| ·表达载体的双酶切 | 第39页 |
| ·连接 | 第39页 |
| ·感受态细胞TOP10F’的制备与转化 | 第39-40页 |
| ·阳性质粒的筛选 | 第40页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第40页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第40-41页 |
| ·酵母菌株KM71H感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第41页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第41-42页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第42页 |
| ·毕赤酵母工程菌蛋白的SDS-PAGE电泳 | 第42-43页 |
| ·毕赤酵母工程菌蛋白的Native-PAGE电泳 | 第43页 |
| ·漆酶活力测定 | 第43页 |
| ·酶学性质 | 第43-44页 |
| ·结果与分析 | 第44-49页 |
| ·漆酶基因的PCR扩增 | 第44页 |
| ·漆酶基因及表达载体的双酶切 | 第44页 |
| ·漆酶基因与表达载体的连接和阳性表达质粒的筛选 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的大量提取及表达载体线性化 | 第45页 |
| ·酵母的电击转化 | 第45页 |
| ·重组酵母阳性筛选 | 第45-46页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第46-47页 |
| ·毕赤酵母工程菌蛋白的电泳 | 第47页 |
| ·酶学性质 | 第47-49页 |
| ·小结 | 第49-51页 |
| 第四章 重组毕赤酵母漆酶表达条件的优化及高密度发酵 | 第51-65页 |
| ·材料与方法 | 第51-52页 |
| ·供试菌种 | 第51页 |
| ·药品与酶 | 第51页 |
| ·主要仪器 | 第51页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-55页 |
| ·单因素对表达的影响 | 第52页 |
| ·多因素对表达的影响 | 第52-53页 |
| ·高密度发酵产漆酶 | 第53-55页 |
| ·结果与分析 | 第55-64页 |
| ·单因素对表达的影响 | 第55-59页 |
| ·多因素对表达的影响 | 第59-62页 |
| ·高密度发酵的结果 | 第62-64页 |
| ·小结 | 第64-65页 |
| 第五章 漆酶基因的定点突变 | 第65-79页 |
| ·材料与方法 | 第65-66页 |
| ·菌株及质粒 | 第65页 |
| ·药品与酶 | 第65页 |
| ·引物设计 | 第65-66页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第66页 |
| ·实验方法 | 第66-73页 |
| ·改造依据 | 第66-71页 |
| ·定点突变 | 第71-72页 |
| ·突变后的重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第72-73页 |
| ·结果与分析 | 第73-77页 |
| ·N208突变结果 | 第73-74页 |
| ·蛋白酶水解位点改造结果 | 第74-75页 |
| ·密码子优化结果 | 第75-76页 |
| ·不同信号肽结果 | 第76-77页 |
| ·添加增强子结果 | 第77页 |
| ·小结 | 第77-79页 |
| 第六章 结果与讨论 | 第79-81页 |
| ·结论 | 第79页 |
| ·展望 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-87页 |
| 详细摘要 | 第87-89页 |
| Abstract | 第89-90页 |