新型DNA碱基甲基化修复酶AlkC的表达、纯化、结晶与功能探讨
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语表 | 第9-10页 |
| 1 前言 | 第10-27页 |
| ·DNA损伤 | 第10页 |
| ·DNA碱基损伤修复机制 | 第10-13页 |
| ·DNA碱基损伤与肿瘤、衰老密切关联 | 第10-12页 |
| ·重组修复机制 | 第12页 |
| ·直接修复机制 | 第12页 |
| ·错配修复机制 | 第12页 |
| ·核苷酸切除修复机制 | 第12-13页 |
| ·碱基切除修复机制 | 第13页 |
| ·DNA糖基化酶 | 第13-22页 |
| ·尿嘧啶DNA糖基化酶 | 第14-16页 |
| ·错配DNA糖基化酶 | 第16-17页 |
| ·甲基化DNA糖基化酶 | 第17-22页 |
| ·AlkC、AlkD的研究概况 | 第22-26页 |
| ·AlkC、AlkD的发现 | 第22页 |
| ·AlkC、AlkD属于同一蛋白质超家族 | 第22-23页 |
| ·AlkC和AlkD对烷基化碱基的移除 | 第23-24页 |
| ·AlkD的三维结构 | 第24-26页 |
| ·结束语 | 第26-27页 |
| 2 研究目的和意义 | 第27-29页 |
| 3 材料和方法 | 第29-40页 |
| ·实验材料 | 第29-31页 |
| ·菌株和质粒 | 第29页 |
| ·酶及主要试剂 | 第29页 |
| ·LB培养基 | 第29-30页 |
| ·蛋白纯化缓冲液 | 第30页 |
| ·高效感受态细胞DH5α制备 | 第30-31页 |
| ·实验仪器 | 第31页 |
| ·实验方法 | 第31-40页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| ·AlkC、AAG和AlkA基因的扩增与纯化 | 第32页 |
| ·双酶切反应 | 第32-33页 |
| ·酶切回收后的PCR产物与载体连接 | 第33页 |
| ·连接产物转化 | 第33页 |
| ·重组子鉴定 | 第33页 |
| ·质粒转化 | 第33-34页 |
| ·目的蛋白表达条件和可溶性条件筛选 | 第34页 |
| ·靶蛋白的大量表达 | 第34-35页 |
| ·靶蛋白的纯化 | 第35-37页 |
| ·浓缩 | 第37页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第37-38页 |
| ·活性测定 | 第38页 |
| ·蛋白质结晶 | 第38-40页 |
| 4 结果与分析 | 第40-71页 |
| ·重组质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·重组子的测序鉴定 | 第41页 |
| ·靶蛋白表达条件筛选 | 第41-46页 |
| ·AlkA表达条件筛选 | 第42-44页 |
| ·AAG表达条件筛选 | 第44-45页 |
| ·AlkC表达条件筛选 | 第45-46页 |
| ·靶蛋白的大量纯化 | 第46-54页 |
| ·AlkA的大量纯化 | 第46-48页 |
| ·AAG的大量纯化 | 第48-50页 |
| ·AlkC的大量纯化 | 第50-54页 |
| ·AlkC的稳定性条件探索 | 第54-57页 |
| ·缓冲体系的筛选 | 第54-56页 |
| ·高盐浓度利于AlkC蛋白纯化 | 第56-57页 |
| ·pSJ2 AlkC表达质粒构建与表达纯化 | 第57-62页 |
| ·引物设计 | 第58页 |
| ·目的基因扩增 | 第58页 |
| ·双酶切检测 | 第58-59页 |
| ·pSJ2 AlkC的表达 | 第59-60页 |
| ·pSJ2 AlkC的大量纯化 | 第60-62页 |
| ·AlkC C端截去27个氨基酸表达载体的构建 | 第62-64页 |
| ·质谱分析 | 第64-65页 |
| ·活性测定 | 第65-69页 |
| ·AlkC的活性测定 | 第65-67页 |
| ·AlkA和AAG的活性测定 | 第67-68页 |
| ·AlkC、AlkA和AAG的活性比较 | 第68-69页 |
| ·AlkC的晶体生长 | 第69-71页 |
| 5 讨论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
