| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 研究背景 | 第13-33页 |
| 1.1 里氏木霉(Trichoderma reesei)概述 | 第13-16页 |
| 1.2 纤维素酶及其应用 | 第16-19页 |
| 1.2.1 纤维素酶 | 第16-17页 |
| 1.2.2 纤维素酶的应用 | 第17-19页 |
| 1.3 转录因子调控纤维素酶基因的表达 | 第19页 |
| 1.4 通过代谢工程手段促进纤维素酶生产 | 第19-20页 |
| 1.5 钙信号通路主要组分及功能 | 第20-24页 |
| 1.5.1 钙信号通路综述 | 第20页 |
| 1.5.2 钙信号通路主要组分及功能 | 第20-23页 |
| 1.5.3 环境刺激下胞内Ca~(2+)的响应 | 第23-24页 |
| 1.6 锰离子(Mn~(2+))对真菌代谢影响的研究进展 | 第24-28页 |
| 1.6.1 Mn~(2+)的吸收、转运机制 | 第24-26页 |
| 1.6.2 Mn~(2+)的解毒机制 | 第26-28页 |
| 1.6.3 PMR1对Mn~(2+)和Ca~(2+)的平衡 | 第28页 |
| 1.7 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)及其应用 | 第28-30页 |
| 1.7.1 DMF概述及应用 | 第28-29页 |
| 1.7.2 含DMF废水处理方法及优缺点 | 第29页 |
| 1.7.3 生物法处理含DMF废水的研究进展 | 第29-30页 |
| 1.8 本论文研究内容及意义 | 第30-33页 |
| 1.8.1 研究内容 | 第30-32页 |
| 1.8.2 研究意义 | 第32-33页 |
| 第2章 Mn~(2+)诱导T.reesei纤维素酶的高产机制 | 第33-78页 |
| 2.1 引言 | 第33页 |
| 2.2 材料 | 第33-43页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第33-34页 |
| 2.2.2 引物序列 | 第34-37页 |
| 2.2.3 主要试剂和耗材 | 第37-38页 |
| 2.2.4 常用试剂配制 | 第38-39页 |
| 2.2.5 主要培养基配制 | 第39-42页 |
| 2.2.6 主要仪器和设备 | 第42-43页 |
| 2.2.7 实验所用程序及软件 | 第43页 |
| 2.3 实验方法 | 第43-59页 |
| 2.3.1 常规基因操作 | 第43-47页 |
| 2.3.2 根瘤农杆菌介导的结合转移 | 第47-50页 |
| 2.3.3 T.reesei RNA提取,反转录合成cDNA及RT-qPCR分析 | 第50-51页 |
| 2.3.4 纤维素酶酶活力测定及蛋白浓度测定 | 第51-54页 |
| 2.3.5 T.reesei菌体生物质含量测定 | 第54-55页 |
| 2.3.6 Mn~(2+)的使用 | 第55页 |
| 2.3.7 其他试剂的使用 | 第55页 |
| 2.3.8 T.reesei菌体生长检测 | 第55页 |
| 2.3.9 胞内外Mn~(2+)含量的测定 | 第55页 |
| 2.3.10 胞内钙离子(Ca~(2+))荧光检测 | 第55-56页 |
| 2.3.11 质粒构建和转化 | 第56-59页 |
| 2.3.12 稳定性分析 | 第59页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第59-77页 |
| 2.4.1 Mn~(2+)处理对T.reesei影响的研究 | 第59-62页 |
| 2.4.2 添加10mM Mn~(2+)对胞内外Mn~(2+)浓度的影响 | 第62页 |
| 2.4.3 T.reesei中锰转运蛋白的鉴定 | 第62-65页 |
| 2.4.4 锰转运蛋白TPH084-1和TPH084-2的亚细胞定位 | 第65-66页 |
| 2.4.5 锰转运蛋白参与Mn~(2+)诱导的纤维素酶生产 | 第66-69页 |
| 2.4.6 Mn~(2+)诱导提高胞内Ca~(2+)含量 | 第69-71页 |
| 2.4.7 Mn~(2+)诱导下,钙通道抑制剂对胞内Ca~(2+)和纤维素酶表达的影响 | 第71-72页 |
| 2.4.8 Mn~(2+)诱导下,CRZ1参与调控纤维素酶表达 | 第72-74页 |
| 2.4.9 Mn~(2+)诱导下,TPMR1参与调控Ca~(2+)/Mn~(2+)及纤维素酶表达 | 第74-77页 |
| 2.5 本章小结 | 第77-78页 |
| 第3章 DMF调控T.reesei纤维素酶的表达和分泌 | 第78-98页 |
| 3.1 引言 | 第78页 |
| 3.2 材料 | 第78-79页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第78页 |
| 3.2.2 引物序列 | 第78-79页 |
| 3.2.3 主要试剂耗材及仪器设备 | 第79页 |
| 3.2.4 培养基及试剂配制 | 第79页 |
| 3.2.5 实验所用程序及软件 | 第79页 |
| 3.2.6 稳定性分析 | 第79页 |
| 3.3 实验方法 | 第79-81页 |
| 3.3.1 DMF的使用 | 第79页 |
| 3.3.2 其他试剂的使用 | 第79-80页 |
| 3.3.3 T.reesei菌体生长检测 | 第80页 |
| 3.3.4 敲除质粒构建和转化 | 第80页 |
| 3.3.5 胞内Ca~(2+)检测 | 第80页 |
| 3.3.6 细胞通透性检测 | 第80页 |
| 3.3.7 转录组测序及数据处理 | 第80-81页 |
| 3.3.8 稳定性分析 | 第81页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第81-96页 |
| 3.4.1 偶然发现—DMF诱导T.reesei高产纤维素酶 | 第81-82页 |
| 3.4.2 外源DMF处理对T.reesei影响的研究 | 第82-84页 |
| 3.4.3 外源DMF处理增加T.reesei细胞的通透性 | 第84-85页 |
| 3.4.4 外源DMF处理对T.reesei纤维素酶相关基因转录水平的影响 | 第85-86页 |
| 3.4.5 转录组测序为DMF诱导的纤维素酶过表达提供了新的见解 | 第86-89页 |
| 3.4.6 钙信号参与DMF诱导的T.reesei中纤维素酶的过表达 | 第89-90页 |
| 3.4.7 DMF诱导的胞内Ca~(2+)增加参与纤维素酶的过表达 | 第90-92页 |
| 3.4.8 DMF通过钙信号通路诱导T.reesei高产纤维素酶 | 第92-94页 |
| 3.4.9 DMF和Mn~(2+)联合应用可显著提高T.reesei Rut-C30的纤维素酶产量 | 第94-95页 |
| 3.4.10 利用DMF开发新的诱导剂的展望 | 第95-96页 |
| 3.5 本章小结 | 第96-98页 |
| 第4章 利用基因工程改造的T.reesei降解废水中DMF | 第98-115页 |
| 4.1 引言 | 第98页 |
| 4.2 材料 | 第98-101页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第98页 |
| 4.2.2 引物序列 | 第98-99页 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 | 第99页 |
| 4.2.4 主要试剂和耗材 | 第99-100页 |
| 4.2.5 常用试剂配制 | 第100页 |
| 4.2.6 主要培养基配制 | 第100-101页 |
| 4.2.7 实验所用程序及软件 | 第101页 |
| 4.2.8 稳定性分析 | 第101页 |
| 4.3 实验方法 | 第101-104页 |
| 4.3.1 DMF及其类似物色谱条件 | 第101页 |
| 4.3.2 DMF标准样品制备 | 第101页 |
| 4.3.3 DMF的使用 | 第101页 |
| 4.3.4 木聚糖酶Ⅰ和木聚糖酶Ⅱ活力测定 | 第101-102页 |
| 4.3.5 纤维素酶对玉米秸秆的糖化水解 | 第102页 |
| 4.3.6 载体构建 | 第102-103页 |
| 4.3.7 异源基因在大肠杆菌(E.coli)的诱导表达 | 第103页 |
| 4.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第103页 |
| 4.3.9 N,N-dimethylformamidase (DMFase)酶活力测定 | 第103页 |
| 4.3.10 DMFase酶学性质测定 | 第103-104页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第104-113页 |
| 4.4.1 DMF标准曲线的绘制 | 第104页 |
| 4.4.2 工业发酵培养基中,DMF对T.reesei Rut-C30影响的研究 | 第104-108页 |
| 4.4.3 DMFase的筛选 | 第108页 |
| 4.4.4 DMFase的异源表达 | 第108-109页 |
| 4.4.5 DMFase的酶学性质鉴定 | 第109-110页 |
| 4.4.6 DMFase的底物特异性 | 第110-111页 |
| 4.4.7 DMF降解途径引入T.reesei细胞 | 第111-112页 |
| 4.4.8 DMF诱导纤维素酶高产与DMF废水降解利用的“一箭双雕” | 第112-113页 |
| 4.5 本章小结 | 第113-115页 |
| 第5章 总结与展望 | 第115-118页 |
| 5.1 总结 | 第115-116页 |
| 5.2 展望 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-135页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第135-136页 |
| 致谢 | 第136页 |
